小麦抗条锈病新基因材料SSH cDNA文库的构建及初步筛选

论文摘要

条锈病(Puccinia striiformis f.sp.tritic)是我国小麦的主要病害,特别是在我国西部地区由于适宜的发病条件,使条锈病近年来成为该小麦生态区最严重的病害。究其原因除条锈菌生理小种变异快,条锈病抗源匮乏,可利用的抗性基因较少,育成小麦品种抗性遗传基础单一等因素以外,一个重要的原因是条锈病原菌与寄主植物互作及植物抗病机理复杂,分子机理尚不清楚,极大地限制了抗条锈病新品种的培育。因此,在不断地发现新的抗性基因,快速培育具有持久抗性的突破性小麦新品种的同时,加强条锈病原菌与寄主识别及植物抗病的分子机理研究,克隆抗条锈病及其相关基因,是推动从根本上解决小麦条锈病威胁的关键。本研究以四川省重点推广的小麦抗条锈病新品种川农19(CN19,含抗条锈病新基因Yr41)为研究材料,采用高灵敏度和高产出率的抑制差减杂交(SSH)技术构建条锈菌诱导表达的SSHcDNA文库,通过筛选文库获得阳性克隆并对相关ESTs进行功能预测分析,以期从基因组水平探讨条锈菌诱导的抗病反应分子机理,为发掘抗条锈病相关基因、开发新的分子标记、新基因Yr41的克隆和分子标记辅助育种奠定基础。主要研究结果如下:1.应用SSH技术成功构建了小麦条锈菌诱导的cDNA文库,获得6972个重组克隆。通过对SSH cDNA文库构建中关键环节,包括总RNA及起始mRNA质量、接头连接效率(70%左右)、差减效率等方面的控制,使之构建的文库质量较好,菌液PCR扩增结果分析发现cDNA插入片段大小主要分布在200—700bp之间,符合实验预期要求,为高效筛选差异表达基因奠定了基础。2.应用cDNA点阵结合正反差别杂交的方法对文库克隆中4000个克隆进行点杂交筛选,得到216个阳性克隆。随机选取60个阳性克隆测序后共获得56个有效ESTs。通过与GenBank中的序列进行BLAST比对分析,获得14个与抗病防卫反应相关的ESTs序列,其中包括1个抗病调控基因,1个病原菌抵御蛋白,1个次生代谢相关酶类,1个水解酶类和2个氧自由基清除酶类。另外34个ESTs主要涉及植物光合作用、能量代谢,基因表达转录后调控等;4个ESTs在数据库中找到相似序列,但功能尚不清楚。除此之外,另有4个ESTs在蛋白数据库中没有显著相似性,可能代表新基因或者变异度较高的cDNA非编码区序列。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1. 植物抗病基因研究进展
• 1.1 植物体抗病机制模型
• 1.2 R基因的作用机制
• 1.3 R基因的克隆及其结构特点
• 2. 小麦抗条锈病基因研究进展
• 3. 植物基因差异表达研究进展
• 3.1 基因差异表达的研究方法
• 3.1.1 mRNA差异显示技术
• 3.1.2 代表性差异分析技术
• 3.1.3 抑制差减杂交技术
• 3.2 差异表达基因的研究现状
• 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 2.1 条锈病菌接种鉴定和抗性诱导
• 2.2 RNA的提取
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 mRNA的纯化
• 2.3 SSH文库的构建
• 2.3.1 第一链cDNA合成
• 2.3.2 第二链cDNA合成
• 2.3.3 Rsa I酶切
• 2.3.4 接头的连接
• 2.3.5 第一次杂交
• 2.3.6 第二次杂交
• 2.3.7 两次PCR扩增
• 2.3.8 连接效率检测
• 2.3.9 差减效率检测
• 2.4 PCR产物的连接转化
• 2.5 重组质粒的转化
• 2.6 重组克隆的鉴定
• 2.7 文库斑点杂交筛选
• 2.7.1 PCR产物点膜
• 2.7.2 探针的标记
• 2.7.3 点杂交
• 2.8 阳性克隆cDNA片段测序及生物信息学分析
• 第三章 结果与分析
• 1. 条锈菌接种后反应型
• 2. RNA的检测
• 3. 酶切结果检测
• 4. 接头连接效率检测
• 5. 两轮抑制PCR结果
• 6. 差减效率检测
• 7. 文库鉴定
• 8. 文库点杂交初步筛选
• 9. 序列比对与功能注释
• 10. 抗病相关ESTs分析
• 10.1 抗病调控基因
• 10.2 病原菌抵御蛋白
• 10.3 重要次生代谢相关酶类
• 10.4 氧自由基清除相关酶类
• 10.5 水解酶类
• 第四章 讨论
• 1. SSH cDNA文库质量评价
• 2. 差异表达基因与材料诱导时间选择
• 3. 两类高频出现ESTs与条锈菌诱导抗性的功能推测
• 3.1 iNOS合成酶活性蛋白
• 3.2 MYB转录因子
• 4. 小麦新基因Yr41抗条锈病反应初探
• 5. SSH文库的利用
• 参考文献
• 致谢