抗逆相关MYB类转录因子和逆境诱导型启动子的分离与鉴定

论文摘要

非生物逆境一直是造成作物减产的重要原因,并且随着全球环境恶化和气候异常将日益危害着粮食生产安全。因此研究作物的抗逆机理和鉴定抗逆相关基因具有重要的意义。挖掘逆境应答中的重要基因和启动子元件并加以利用,可以提高植物的抗逆性。本研究分为两部分内容：一是MYB类转录因子的分析和功能鉴定,通过对14个MYB候选基因的逆境表达谱分析结合其转基因超表达植株的抗逆性鉴定,筛选出对低温和高盐胁迫调控有关的基因CST1（Cold and salt tolerance 1,OsMYB30）,并对其进行了初步的功能鉴定；二是逆境诱导型启动子的分离和鉴定,通过对候选启动子的分离和逆境表达活性鉴定,发现了一个受干旱强烈诱导的启动子。研究的主要结果发下：1.对14个候选MYB基因进行了超表达载体的构建并转化了水稻粳稻品种中花11；2.通过对超表达转基因植株的苗期逆境抗性筛选,发现了两个与抗逆相关的候选基因。CST1超表达植株对低温和高盐胁迫呈现出敏感的表型,是本研究的重点。3.通过生物信息学分析CST1属于R2R3-MYB,从DNA结合结构域的进化关系上来分析,该蛋白与拟南芥中MYB15和水稻中的Osmyb4关系最近。4.CST1基因的表达呈现一定的组织特异性,在颖壳和二次支梗中表达量相对较高,在发芽后的幼芽和花药中也相对较高。同时该基因受到低温胁迫的持续上升诱导表达,在高盐胁迫时下调表达。5.该基因的T-DNA插入突变体cstl显著降低了CST1的表达量,其纯合家系对低温和高盐胁迫的耐受性相对于野生型明显增强。6.通过Real-time PCR分析了一些冷应答相关基因的表达量,发现DREB/CBF转录因子以及其他已发表的基因并没有差异表达,表明这些基因很可能并不受CST1的调控。7.通过芯片数据分析CST1超表达、突变体和野生型植株在正常生长条件下以及低温胁迫条件下基因的表达量差异,大量的基因在表达水平发生了变化,表明CST1在冷胁迫应答中发挥着重要的转录调节的作用。8.对12个候选启动子进行了分离和构建GUS报告基因的表达载体,并转化了水稻粳稻品种中花11。9.对5个候选启动子的转基因植株进行了逆境条件下的GUS活性定量分析,发现了一个受干旱强烈诱导的启动子Oshox24P,其余均受逆境诱导比较微弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1. 前言
• 1.1 植物非生物逆境胁迫
• 1.1.1 植物非生物逆境胁迫的一般信号途径
• 1.1.2 植物非生物逆境与转录因子调控
• 1.2 MYB转录因子
• 1.2.1 MYB转录因子概述
• 1.2.2 MYB与非生物逆境胁迫
• 1.3 非生物逆境诱导型启动子
• 1.3.1 植物中不同类型的启动子的分离和应用
• 1.3.2 非生物逆境诱导型启动子的序列结构特征
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 水稻材料、菌株及载体
• 2.2 候选基因和候选启动子
• 2.3 引物
• 2.4 载体构建与水稻的遗传转化
• 2.4.1 载体构建
• 2.4.2 水稻遗传转化
• 2.5 基因表达分析
• 2.6 水稻植株的苗期逆境胁迫处理和激素处理
• 2.6.1 高盐胁迫
• 2.6.2 ABA胁迫
• 2.6.3 干旱胁迫
• 2.6.4 冷胁迫
• 2.7 抗逆性相关生理指标测定
• 2.7.1 脯氨酸含量测定
• 2.7.2 钠、钾离子浓度测定
• 2.7.3 细胞膜透性测定
• 2.8 GUS活性分析
• 2.8.1 GUS染色
• 2.8.2 GUS定量分析
• 3 结果与分析
• 3.1 MYB类转录因子的分离与鉴定
• 3.1.1 候选基因的载体构建及遗传转化结果
• 3.1.2 候选基因的蛋白质序列分析
• 3.1.3 转基因植株的超表达检测及逆境筛选
• 3.1.4 M2基因的功能研究
• 3.1.4.1 M2的序列分析
• 3.1.4.2 M2的表达模式分析
• 3.1.4.3 M2超表达植株的ABA敏感表型分析
• 3.1.5 CST1（M3）基因的功能研究
• 3.1.5.1 CST1的序列分析
• 3.1.5.2 CST1的表达模式分析
• 3.1.5.3 CST1超表达盐敏感表型分析
• 3.1.5.4 CST1超表达冷敏感表型分析
• 3.1.5.5 T-DNA插入突变体cst1鉴定及逆境表型分析
• 3.1.5.6 CST1冷应答过程中冷相关基因的表达量分析
• 3.1.5.7 CST1超表达植株和突变体植株的全基因组芯片表达谱分析
• 3.2 逆境诱导型启动子的分离与鉴定
• 3.2.1 候选启动子的筛选与确定
• 3.2.2 候选启动子载体构建与转化结果
• 3.2.3 候选启动子的序列分析
• 3.2.4 候选启动子的组织GUS染色
• 3.2.5 候选启动子的逆境诱导GUS活性
• 4 讨论
• 4.1 CST1基因功能的探讨
• 4.1.1 CST1与其它MYB基因的异同
• 4.1.2 CST1可能参与不依赖DREB转录因子的冷胁迫调控途径
• 4.1.3 CST1负调控冷胁迫应答的可能机制
• 4.1.4 CST1负调控盐胁迫应答的可能机制
• 4.1.5 CST1后续工作的开展
• 4.2 Oshox24P启动子的探讨
• 4.2.1 Oshox24P的启示
• 4.2.2 启动子在植物基因工程中应用
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ. 部分实验的详细操作程序
• 附录Ⅱ. 作者简介