基于干细胞模型的落叶松遗传转化体系的建立及优化

论文摘要

落叶松（Larix Mill）是我国北方重要的速生用材造林树种,开展落叶松分子育种研究、加速其遗传改良进程是现代高效人工林培育的一个重要任务。植物体细胞胚胎发生相似于合子胚发育,是植物人工胚胎研究与应用的重要途径,是林木品种改良、无性繁殖与基础研究的理想实验体系,也是基因工程的桥梁。建立并优化基于干细胞模型的落叶松转基因技术体系,将外源基因高效导入落叶松基因组,进行重要目标性状基因功能验证及表达调控研究、加速落叶松生物育种进程具有重要的科学意义及应用价值。本文以落叶松为实验材料,根据39个细胞系原胚发育与体细胞胚成熟情况,筛选出细胞系638、119、113等三个细胞系作为转化细胞系;并进行其抗生素敏感性实验,利用农杆菌介导法进行遗传转化体系研究,主要研究结果如下:1.通过对39个落叶松细胞系的原胚组织与体细胞胚成熟及发育状况筛选研究,表明日本落叶松（Larix leptolepis）638、113两个细胞系与长白落叶松（L. olgensis）109细胞系的再生能力强,三个细胞系可以用于遗传转化研究,可作为农杆菌转化的受体材料。2.通过对筛选性抗生素—卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）以及抑菌性抗生素—头孢霉素（Cef）及羧苄青霉素（Cb）研究表明:（1） Kan对细胞系638、109、113的敏感性临界浓度分别为25mg/L、20mg/L、15mg/L;Hyg分别为5mg/L、3mg/L、3mg/L;在临界浓度时,Hyg比Kan作用快;（2） Cef抑制农杆菌生长的合适浓度为300mg/L;在300-500mg/L浓度范围内,Cef促进该细胞系的生长,而Cb则具有抑制作用。3.通过农杆菌介导的落叶松细胞系遗传转化中受体材料基因型、培养方式、菌液浸染浓度和时间、共培养时间等因素影响研究表明:（1）以携带质粒pCHF3-gp和pSuper1300+-HC的农杆菌转化细胞系638、109、113,获得54个抗性细胞系,经分子检测进一步获得10个转基因株系;（2）以固体培养基上的638为受体,经浓度OD600值0.4-0.6携质粒pSuper1300+-HC的农杆菌浸染10-20min,共培养2d,转化效率可达（0.94个/g）,表明细胞系638是较为理想的转化受体;（3）Kan筛选获得的抗性细胞系较少,且假阳性率较高;而Hyg筛选则能获得较多抗性细胞系,且假阳性率低。表明Kan与Hyg筛选效率差别较大。综上所述,我们建立并优化了农杆菌介导的落叶松细胞系遗传转化体系,总结并优化了前三部分研究成果,阐述了已建立的基于干细胞模型的农杆菌介导的落叶松遗传转化体系,对落叶松遗传发育及进一步分子育种提供了科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目的及意义
• 1.2.1 研究目的
• 1.2.2 研究意义
• 1.3 国内外研究现状及评述
• 1.3.1 落叶松干细胞模型
• 1.3.2 针叶树组织培养研究进展
• 1.3.3 针叶树遗传转化方法
• 1.3.4 农杆菌介导遗传转化机理
• 1.3.5 农杆菌介导的针叶树遗传转化研究进展
• 1.4 研究内容
• 1.5 技术路线
• 1.6 项目来源及经费支持
• 第二章 遗传转化受体细胞系的确定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基及培养条件
• 2.1.3 研究方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 细胞系增殖及体细胞胚胎成熟诱导
• 2.2.2 体细胞胚发育及试管苗的获得
• 2.2.3 遗传转化受体细胞系的确定
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 筛选及抑菌抗生素敏感性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 抗生素
• 3.1.3 方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 Kan 处理下3 种细胞系的生长情况
• 3.2.2 Hyg 处理下3 种细胞系的生长情况
• 3.2.3 Cef 和Cb 对细胞系生长的影响
• 3.3 小结与讨论
• 3.3.1 落叶松细胞系对筛选抗生素的敏感性反应
• 3.3.2 不同抑菌抗生素对细胞系生长的作用
• 3.3.3 小结
• 第四章 落叶松细胞系遗传转化因素的优化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 转化方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 抗性细胞系的获得
• 4.2.2 转基因分子检测
• 4.2.3 转基因植株的获得
• 4.3 小结与讨论
• 4.3.1 受体材料不同基因型及生理状态对遗传转化的影响
• 4.3.2 转化条件对遗传转化的影响
• 4.3.4 转基因细胞系体细胞胚胎发生及植株再生
• 4.3.5 小结
• 第五章 落叶松遗传转化体系优化
• 1.落叶松遗传转化体系的技术路线
• 2.试剂及培养基
• 3.仪器设备
• 4.材料准备及再生能力检测
• 5.抗生素使用方案的校正
• 6.转化
• 7.转基因检测
• 8.转基因胚性组织获得及再生
• 第六章 结论
• 参考文献
• 在读期间的学术研究
• 致谢
• 详细摘要