小鼠精原细胞与精母细胞miRNA差异表达及功能研究

论文摘要

microRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸,在物种间广泛分布并高度保守的非编码小分子RNA。miRNA通常以不完全互补方式识别结合mRNA的3端非翻译区,进而在转录后水平发挥负调控作用。其作用形式包括介导靶mRNA降解或翻译抑制。现已发现miRNA参与细胞周期、细胞分化及肿瘤形成等多种生物过程。miRNA在表达上具有时空特异性,该特点使其与发育及分化过程密切相关。精子发生是指精原细胞经过细胞增殖、减数分裂及精子细胞形成三个阶段最终分化为单倍体成熟精子的周期性多级分化发育过程。以小鼠为例,其精原细胞首见于出生后第6天,约2天后出现B型精原细胞,并在第10天出现前细线期精母细胞,而圆形精子细胞的出现则需要20天,其第一波精子发生过程大约持续35天。众所周知,发育过程涉及一系列转录及转录后的基因表达调控,而miRNA作为新涌现出来的转录后调控因子白发现以来倍受研究学者们的关注。近年来,有关miRNA在精子发生中的作用已迅速成为男性生殖领域研究的热点。例如,miR-122a主要在晚期生精细胞中表达并通过降解靶mRNA的方式抑制过渡蛋白2（Transition Protein 2,Tnp2）的表达,而后者作为圆形精子细胞的一个标志物参与减数分裂后期的染色质重塑,提示miR-122a在减数分裂后期生精细胞中发挥重要作用。最近的研究表明miR-34c可通过增强生精细胞特异标志物的表达进而促进晚期精子发生。本实验室保有的两个生精细胞系GC-1 spg和GC-2 spd分别代表B型精原细胞及减数分裂前期精母细胞。两者在精子发生中可视为减数分裂前的两个连续的细胞分化时相,准确地说两者处于由有丝分裂向减数分裂转变的过渡阶段。对其进行表达谱分析可能有助于诠释精子发生中减数分裂的发生机制。本研究中,我们通过miRNA芯片技术对GC-1与GC-2细胞中的miRNA进行差异表达分析。分析数据结果并按GC-1/GC-2表达比值>2或<0.5筛选差异表达的miRNA,从中发现20个表达下调、8个表达上调的候选miRNA.通过real time PCR法验证芯片结果,我们鉴定了4个GC-1细胞高表达的miRNA,分别是miR-15a、miR-125a-5p、miR-184及miR-468。应用miRanda、TargetScan及PicTar等生物信息学软件对上述候选miRNA进行靶基因预测,并通过双荧光素酶报告基因分析对预测的靶基因进行筛选,结果显示在众多预测靶基因中,仅miR-15a的一个潜在靶基因Ccnt2可以引起荧光素酶活性的显著降低。作为miR-15a/miR-16-1基因簇的一员,miR-15a一直被视为重要的肿瘤抑制因子,并通过特异性靶向各种致癌基因而与抑制细胞增殖、促进凋亡及抑制肿瘤发生密切相关,其表达下调见于多种癌症。Cyclin T2 （Ccnt2）是近十年来新发现的T型Cyclin家族的一员,包含两个选择性剪接体（Cyclin T2a与Cyclin T2b）,并在组织之间广泛表达。Cyclin T2与CDK9共同组成异源二聚体复合物P-TEFb （positive transcription elongation factor b）并通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ, RNAPⅡ）羧基末端结构域（carboxyl-terminal domain, CTD）进而促进转录延伸。通常认为,该复合物发挥作用并不依赖细胞周期进程。目前,Ccnt2的功能尚不十分清楚,已明确的是其在肌细胞分化中具有重要意义。通过对8株小鼠细胞系进行Ccnt2及miR-15a的表达谱分析,我们发现两者之间存在表达上的互反关系。对Ccnt2潜在靶位点的保守性分析显示其在物种之间高度保守。为了验证miR-15a与Ccnt2之间的关系,我们对Ccnt2潜在靶位点进行了突变体报告基因分析,结果显示miR-15a可直接调控Ccnt2且位于miR-15a 3端的碱基配对对于其识别Ccnt2更加重要。此外,Western blot结果显示应用miR-15a模拟物（mimic）或抑制物（inhibitor）转染GC-1细胞可分别明显降低或增加Ccnt2的表达量；进一步的拯救实验结果表明Ccnt2 siRNA可明显抑制Ccnt2表达,而此抑制作用可被miR-15a inhibitor恢复,从而证明Ccnt2是miR-15a的直接靶基因。鉴于CDK9/Ccnt2复合物参与肌细胞分化过程,我们设想miR-15a可能参与调节该过程,并利用可诱导分化的小鼠成肌细胞模型C2C12进行后续研究。利用miR-15a mimic或Ccnt2 siRNA转染C2C12细胞,real time PCR结果表明唯有miR-15a mimic处理组过表达niR-15a,且siRNA与miR-15a均可使Ccnt2 mRNA表达降低,提示miR-15a通过降解途径抑制Ccnt2表达。之后对转染miR-15a的C2C12细胞进行诱导分化,并在不同时间点上观察早期分化标志物（myogenin）及晚期分化标志物（myosin heavy chain, MHC）的表达变化。结果显示随着分化进程,myogenin及MHC的表达量均连续增加,而Ccnt2的表达量却逐渐降低,提示Ccnt2对细胞分化的起始阶段有重要作用。与对照组相比,miR-15a处理组中myogenin及MHC的表达量均减少；而从细胞形态上看,miR-15a对肌管形成有明显抑制作用。由此可见,miR-15a通过靶向Ccnt2进而对成肌细胞的分化起负调控作用。由于缺乏生精细胞分化的体外模型,难以直接观察到Ccnt2及miR-15a对生精细胞分化的影响,因而我们收集发育中的小鼠睾丸,并在不同水平上对两者的表达情况进行检测。Real time PCR结果显示,Ccnt2 mRNA在出生后3周内连续增加并在第4周突然降低,提示其对早期精子发生意义重大.而Western blot结果显示,Ccnt2较大的剪接体（小鼠的Cyclin T2a）在第3周时表达量突然升高,随后基本稳定；而较小的剪接体（小鼠的Cyclin T2b）则在第3周时表达量突然降低,之后变化也不大,提示Ccnt2的两个剪接体在睾丸发育的不同阶段分别发挥主要作用。对miR-15a的平行检测表明,miR-15a在出生后,尤其是出生后3周内连续降低,在表达上与Ccnt2恰好相反。因此,Ccnt2与miR-15a可能在早期精子发生中发挥重要作用。综L所述,我们鉴定了4个在小鼠减数分裂前生精细胞中差异表达的miRNA,预测并证实Ccnt2是miR-15a的一个直接靶基因。同时,我们首次报道miR-15a通过靶向Ccnt2进而对肌细胞分化发挥负调控作用。此外,通过对发育中小鼠睾丸的表达谱分析,我们观察到了Ccnt2与miR-15a在出生后3周内的表达量变化呈互反关系,提示它们参与早期精子发生过程。鉴于miR-15a具有肿瘤抑制因子的特征,结合本研究的发现,miR-15a将可能在男性避孕及睾丸癌、男性不育症的治疗方面拥有广阔的前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 1. 小鼠精原细胞、精母细胞miRNA差异表达分析
• 2. 差异表达miRNA的靶基因预测与筛选
• 3. miR-15a与Ccnt2调控关系的验证
• 4.1 miR-15a通过靶向Ccnt2参与调节成肌细胞分化
• 5. Ccnt2与miR-15a在小鼠睾丸发育中的表达谱分析
• 讨论
• 1. miRNA差异表达分析
• 2. miRNA靶基因预测与筛选
• 3. miR-15a/Ccnt2对应关系的验证
• 4. miR-15a/Ccnt2的功能研究
• 5. 本研究的不足与展望
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间论文与会议摘要写作情况