论文摘要
肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种不同致病因子引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝脏主要的纤维生成细胞,在肝纤维化过程中扮演重要角色。交感神经系统（sympathetic nervous system, SNS）是肝内神经的重要组成部分,参与肝脏功能、新陈代谢等方面的调控。近来越来越多的研究显示,交感神经系统可以通过对HSC增殖和凋亡等细胞行为的调节,影响肝脏纤维化的发生和发展。卡维地洛是新一代具有血管扩张作用的非选择性β受体阻滞剂,兼有α1拮抗作用,其在心肌梗死和慢性心力衰竭中的有益作用已为大规模临床试验所证实。研究发现卡维地洛可能是通过其交感神经受体阻滞作用直接抑制成纤维细胞的增殖,进而阻止细胞外间质（extracellular matrix, ECM）的合成,以达到减轻心脏间质重塑、预防心力衰竭发生发展的作用。但是,在肝纤维化形成过程中,通过阻断SNS的经典神经递质去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）与其特定肾上腺素能受体相结合,进而影响肝纤维化的发生发展的相关研究,目前国内外均少有报道。目的:观察卡维地洛对胆汁淤积性大鼠纤维化肝组织中HSC活化增殖、凋亡以及胶原代谢的影响,探讨卡维地洛预防肝纤维化发生发展的可能作用。方法:采用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,并给予肾上腺素能受体阻滞剂卡维地洛作为药物干预,通过HE、Masson染色等了解肝纤维化程度,羟脯氨酸测定法明确肝脏胶原合成能力,免疫组织化学、TUNEL方法测定HSC活化增殖及凋亡情况,Western Blot、Real time Q-PCR检测MMP-13以及TIMP-1表达在肝纤维化发展过程中的动态变化。结果:1术后大鼠一般情况观察大鼠胆总管结扎后1 h～2 h恢复活动,48 h左右尿液变黄,3～4天后皮肤毛发开始转黄,精神逐渐变差,进食量少于对照组,体重增加不明显或稍有下降。8～9天后逐渐出现嗜睡,反应迟钝,活动减少,黄疸明显,鼠粪呈灰白色。20天后进食量明显减少,体重与对照组相比明显降低,并且部分大鼠逐渐出现腹部隆起。2胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型成功建立模型大鼠肝脏肉眼观呈褐绿色或棕色,表面略呈细颗粒状,质地变硬,造模4 wk组共3只大鼠有腹水产生。HE及Masson三色染色显示,假手术对照组肝小叶结构完整,肝板排列整齐,肝细胞无肿胀,无胆管增生,无淤胆及淋巴细胞浸润,核仁清晰,少量结缔组织局限于门管区。造模2 wk后,模型组肝板正常排列消失,小叶结构紊乱,门管区小胆管广泛增生,并向小叶内延伸、肝小叶呈花环状;新生小胆管周围纤维组织增生,门管区面积扩大,肝小叶内亦有纤维组织增生。造模4 wk后,模型组肝脏广泛纤维结缔组织增生,增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割,改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。3卡维地洛对肝脏病理组织学的影响HE染色显示,造模2 wk后,卡维地洛各剂量组较模型组纤维组织及小胆管增生少,肝索迂曲较轻,肝小叶结构破坏较轻;造模4 wk后,卡维地洛各剂量组仍有肝小叶正常结构部分破坏,但小叶周边及汇管区纤维组织增生较轻,肝索紊乱较模型组轻,并可见肝细胞再生现象。Masson三色染色显示,造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组胶原面积密度（16.56%±2.11%,16.17%±1.25%,14.19%±1.41%,12.87%±1.11%）均显著高于假手术对照组（3.4%±0.24%）,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;中、大剂量给药组与模型组相比有明显降低,分别P<0.05、P<0.01;中、大剂量给药组与小剂量组相比也有明显降低,分别P<0.05、P<0.01;中、大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组胶原面积密度（34.35%±3.27%,31.02%±2.75%,28.64%±2.44%,24.18%±2.49%）均显著高于假手术对照组（3.46%±0.17%）,P<0.01;小、中、大剂量给药组均与模型组相比也均有明显降低,分别P<0.05、P<0.01、P<0.01;大剂量给药组与小、中剂量组相比有明显降低,分别P<0.01、P<0.05;而小、中剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。4卡维地洛对大鼠纤维化肝组织中HSC活化增殖和凋亡的影响4.1卡维地洛抑制HSC活化增殖α-SMA免疫组织化学染色显示:假手术对照组大鼠肝组织中仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达;随着肝纤维化的发展,大鼠肝脏中α-SMA阳性细胞明显增多,主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞。造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织α-SMA的阳性面积密度（23.77%±2.43%,21.96%±2.03%,19.95%±2.02%,18.77%±2.15%）均显著高于假手术对照组（5.69%±1.15%）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比有明显降低,P<0.01;大剂量给药组与小剂量组相比也有明显降低,P<0.05;而小剂量给药组与模型组、小剂量与中剂量给药组以及中剂量与大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织α-SMA的阳性面积密度（36.88%±2.83%,33.86%±2.23%,30.77%±2.17%,28.72%±1.74%）均显著高于假手术对照组（5.43%±1.03%）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比有明显降低,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;中、大剂量给药组与小剂量组相比也有明显降低,分别P<0.05,P<0.01;而中剂量与大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。4.2卡维地洛促进活化的HSC凋亡α-SMA与TUNEL双重染色显示:造模2 wk后,假手术对照组未见凋亡的HSC。中、大剂量给药组大鼠HSC凋亡指数（6.45%±1.12% , 7.89%±1.06%）均显著高于模型组（4.95%±0.95%） ,分别P<0.05 , P<0.01 ;小剂量给药组（5.19%±1.09%）与模型组之间无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显升高,分别P<0.01,P<0.05;而小、中剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,假手术对照组未见凋亡的HSC。中、大剂量给药组大鼠HSC凋亡指数（4.63%±1.06%,6.17%±1.27%）均显著高于模型组（2.35%±0.94%）,分别P<0.05,P <0.01;小剂量给药组（3.12%±1.04%）与模型组之间无明显差异,P> 0.05;中、大剂量组给药组与小剂量组相比均有明显升高,分别P<0.05,P <0.01。大剂量组给药组与中剂量组相比也有明显升高,P<0.05。5卡维地洛对大鼠纤维化肝组织中胶原表达的影响5.1卡维地洛降低肝组织中羟脯氨酸含量造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织羟脯氨酸含量（0.363±0.027,0.338±0.028,0.315±0.034,0.279±0.031）μg·mg-1（肝组织湿重）均显著高于假手术对照组（0.163±0.007）μg·mg-1,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,分别P<0.05、P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量组给药组与小、中剂量组相比明显降低,分别P<0.01、P<0.05;而小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织羟脯氨酸含量（0.778±0.052,0.719±0.024,0.654±0.048,0.605±0.034）μg·mg-1（肝组织湿重）均显著高于假手术对照组（0.164±0.006）μg·mg-1,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,分别P<0.05、P<0.01、P<0.01;中、大剂量给药组与小剂量组相比有明显降低,分别P<0.05、P<0.01;而大剂量给药组与中剂量相比也有明显降低,P<0.05。5.2卡维地洛抑制肝组织Ι型胶原mRNA的表达造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ι型胶原mRNA相对表达量（6.07±0.51,5.64±0.43,5.1±0.49,4.44±0.62）均显著高于假手术对照组（1.00±0.14）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比有明显降低,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显降低,分别P<0.01,P<0.05;但小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ι型胶原mRNA相对表达量（11.59±1.1,10.26±0.99,9.73±1.3,8.25±0.91）均显著高于假手术对照组（1.00±0.18）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显降低,分别P<0.01,P<0.05;但小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。6卡维地洛对大鼠纤维化肝组织中TIMP-1和MMP-13蛋白表达的影响6.1卡维地洛促进肝组织中MMP-13蛋白表达Western Blot分析显示:造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13蛋白相对表达量（1.1±0.11,1.27±0.11,1.30±0.13,1.43±0.1）均显著高于假手术对照组（0.72±0.09）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,分别P<0.05、P<0.05、P<0.01;大剂量给药组与小剂量组相比有明显升高,P<0.05,但与中剂量组相比无明显差异P>0.05;小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13蛋白相对表达量（1.73±0.14,1.85±0.15,2.05±0.20,2.28±0.13）均显著高于假手术对照组（0.75±0.06）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;中、大剂量给药组与小剂量组相比均有明显升高,分别P<0.05、P<0.01;大剂量给药组与中剂量组相比也有有明显升高,P<0.05。6.2卡维地洛抑制肝组织中TIMP-1蛋白表达Western Blot分析显示:造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织TIMP-1蛋白相对表达量（1.51±0.18,1.4±0.15,1.22±0.15,1.12±0.16）均显著高于假手术对照组（0.5±0.08）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小剂量组相比有明显降低,P<0.01,但与中剂量组相比无明显差异,P>0.05;小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织TIMP-1蛋白相对表达量（2.53±0.21,2.33±0.16,2.15±0.19,1.94±0.13）均显著高于假手术对照组（0.55±0.05）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与中、小剂量组相比均有明显降低,分别P<0.05、P<0.01;小、中剂量组之间相比无明显差异,P>0.05。6.3卡维地洛在蛋白水平上恢复肝组织中TIMP-1与MMP-13的动态平衡造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13/TIMP-1的比值（0.74±0.08,0.91±0.10,1.07±0.18,1.29±0.11）均显著低于假手术对照组（1.42±0.06）,分别P <0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05。中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显升高,P<0.01;小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13/TIMP-1的比值（0.69±0.09,0.79±0.10,0.95±0.05,1.18±0.08）均显著低于假手术对照组（1.37±0.10）,P <0.01。中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;中、大剂量给药组与小剂量组相比均有明显升高,分别P<0.05,P<0.01;大剂量给药组与中剂量组相比也有有明显升高,P<0.01。7卡维地洛对大鼠纤维化肝组织中TIMP-1和MMP-13 mRNA表达的影响7.1卡维地洛促进肝组织中MMP-13 mRNA表达造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13 mRNA相对表达量（4.89±0.54 , 5.19±0.46 ,5.6±0.64,6.05±0.68）均显著高于假手术对照组（1.38±0.22）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,分别P<0.05,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小剂量组相比有明显升高,P<0.05,但与中剂量组相比无明显差异,P>0.05;中剂量给药组与小剂量组相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13 mRNA相对表达量（6.25±0.63 , 7.27±0.89 ,7.91±0.98,8.92±0.83）均显著高于假手术对照组（1.4±0.15）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显升高,分别P<0.01,P<0.05;中剂量给药组与小剂量组相比无明显差异,P>0.05。7.2卡维地洛抑制肝组织中TIMP-1 mRNA表达造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织TIMP-1 mRNA相对表达量（7.56±0.98 , 6.72±0.97 ,5.85±0.79,5.13±0.97）均显著高于假手术对照组（1.00±0.17）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小剂量组相比有明显降低,P<0.01,但与中剂量组之间相比无明显差异,P>0.05;中、小剂量组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织TIMP-1 mRNA相对表达量（11.72±1.03,10.34±1.08,9.39±1.13,8.11±1.06）均显著高于假手术对照组（1.00±0.21）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比均有明显降低,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;大剂量给药组与小、中剂量组相比均有明显降低,分别P<0.01,P<0.05;但中、小剂量组之间相比无明显差异,P>0.05。7.3卡维地洛在基因水平上恢复肝组织中TIMP-1与MMP-13的动态平衡造模2 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13/TIMP-1基因表达的比值（0.66±0.16,0.78±0.09,0.96±0.09,1.19±0.12）均显著低于假手术对照组（1.37±0.17）,分别P <0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05;中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,均为P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;中、大剂量给药组与小剂量组相比均有明显升高,分别P<0.05,P<0.01;大剂量给药组与中剂量组相比也有明显升高,P<0.05。造模4 wk后,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MMP-13/TIMP-1基因表达的比值（0.54±0.09,0.71±0.12,0.83±0.13,1.07±0.1）均显著低于假手术对照组（1.39±0.19）,P<0.01。中、大剂量给药组与模型组相比均有明显升高,均为P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;大剂量给药组与小、中剂量组相比也均有明显升高,P<0.01;中、小剂量组之间相比无明显差异,P>0.05。结论:1卡维地洛可以抑制在体HSC活化增殖,促进活化的HSC凋亡。2卡维地洛可以抑制大鼠纤维化肝组织中TIMP-1的表达,促进MMP-13的表达,从而恢复TIMP-1与MMP-13的动态平衡,进一步降解肝脏胶原。3卡维地洛可以抑制实验性大鼠肝纤维化的进展,并且在一定程度上随着剂量增大效果更强。
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