论文摘要
目的结肠癌是严重威胁人类的疾病,化学治疗是结肠癌治疗的重要手段,而化疗药物耐药是肿瘤药物治疗中的棘手问题。研究肿瘤耐药机制对于克服肿瘤耐药提高病人存活期具有重要意义。miRNA是一类具有广泛调控功能的非编码小RNA分子。本实验室前期研究发现,miR-20a在结直肠腺癌细胞系SW620较SW480表达水平高,而SW620细胞对多种化疗药物敏感性较SW480细胞低。本研究旨在探讨结直肠腺癌细胞系SW620和SW480中,miR-20a是否影响结直肠腺癌细胞系对化疗药物反应性,并进一步揭示miR-20a的可能靶基因。揭示miRNA在肿瘤耐药过程中的作用,有利于阐明miRNA在肿瘤靶向治疗中的作用,为肿瘤药物靶向性治疗提供理论基础。方法本实验室利用miRNA芯片比较了结直肠腺癌细胞系SW620和SW480miRNA表达谱的差异,发现rniR-20a在SW620中高表达。我们利用MTT法测定了SW620和SW480对结肠癌几种常用化疗药物的敏感性,发现与SW480相比,SW620对多种化疗药物敏感性低。接下来我们测定了miR-20a不同表达水平对结直肠腺癌细胞化疗敏感性的影响。首先在SW620中利用20a-ASO降低／封闭miR-20a,在SW480中利用siR-20a过表达miR-20a,利用MTT法测定SW620细胞和SW480细胞对化疗药物的敏感性的变化。在确定了]miR-20a与肿瘤细胞对化疗药物敏感性相关后,我们接下来进一步确定miR-20a的靶基因。首先利用靶基因预测程序搜索miR-20a可能的靶基因,选择rniRanda, TargetScans和PicTar三种算法重叠预测的基因,作为进一步验证的候选靶基因。候选靶基因的验证采用EGFP荧光报告载体系统进行直接验证,首先设计合成候选靶基因的3’UTR扩增引物,PCR扩增后,将其克隆至绿色荧光蛋白EGFP编码基因的下游,构建荧光报告载体,另外设计特异性突变候选基因3’UTR中miR-20a互补结合位点的引物,同样的方法构建候选靶基因3’UTR突变的荧光报告载体,然后与20a-ASO和siR-20a共转SW620和SW480细胞,60h后裂解细胞,利用荧光分光光度计测定GFP的表达,观察降低／封闭和过表达miR-20a对荧光蛋白EGFP表达的影响。最后,利用RT-PCR的方法检测20a-ASO和siR-20a降低／封闭和过表达miR-20a对细胞内源性靶基因mRNA表达水平的影响。结果在高表达miR-20a的SW620细胞中利用20a-ASO封闭miR-20a后,细胞对化疗药物敏感性增加,而利用siR-20a在SW480细胞中过表达miR-20a后,细胞对多种化疗药物敏感性降低,各药物浓度下细胞死亡率降低。利用MiRanda, TargetScans和Pictar靶基因预测程序预测并结合基因功能分析,选择bnip2、fastk、gab1作为进一步验证的miR-20a靶基因。荧光报告载体实验结果发现,利用20a-ASO封闭miR-20a后,荧光报告载体EGFP表达比对照组增高；当突变3’UTR中niR-20a结合位点后,EGFP表达与对照组没有差异。说明niR-20a可以直接靶定bnip2、fastk、gab13’UTR调节荧光蛋白EGFP的表达。利用20a-ASO封闭miR-20a后,RT-PCR检测到细胞内源性bnip2、fastk、gab1mRNA水平升高,而过表达miR-20a后,内源性bnip2、fastk mRANA水平降低,从而验证了miR-20a影响bnip2、fastk、gab1mRNA水平。结论本研究分别利用2Oa-ASO和siR-20a降低/封闭和过表达miR-20a后,用MTT法测定了细胞对化疗药物反应性的变化,发现高表达miR-20a后细胞对化疗药物敏感性降低,而降低/封闭rniR-20a后细胞对化疗药物的敏感性增强,首次发现了miR-20a能够介导结直肠腺癌细胞系的耐药性。结合生物信息学预测,利用荧光报告系统首次确定了bnip2、fastk、gabl是miR-20a的靶基因,miR-20a影响细胞内源性bnip2、fastk、gab1mRNA水平。综上所述,RT-PCR结果显示,miR-20a可能通过靶定bnip2、fastk、gab1介导结直肠腺癌细胞对化疗药物的耐受。提示miR-20a可能是逆转肿瘤细胞耐药的新的作用靶点。
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