脑红蛋白在肢体缺血预处理脑保护中的作用及其机制

论文摘要

缺血性脑病具有发病率、致残率和死亡率高的特点,严重危害人类的健康。且近年来其发病率呈不断上升的趋势,随着我国老龄化社会的到来,形势将更加严峻。调动机体内源性保护机制提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力作为缺血性脑病防治的新策略,受到医学界的高度重视。Kitagawa等在脑缺血模型中发现单次或两次的预缺血,可对后续缺血的海马CA1区锥体神经元产生保护作用,被称为脑缺血耐受,提前给与的轻微脑缺血称为脑缺血预处理。这表明脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受能减轻缺血/再灌注所致的损伤。近年来提出的远程器官缺血预处理拓宽了预处理的途径,同时也为应用非重要生命器官的短暂缺血预处理对抗重要生命器官的缺血/再灌注损伤研究提供了新思路。我室近年研究证实肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning,LIP）可减轻大鼠海马的缺血/再灌注损伤。脑缺血预处理和LIP均可减轻脑的缺血/再灌注损伤,但从临床应用考虑,LIP具有较好的可操作性和安全性,更易为患者所接受,但这种保护作用的机制尚不完全清楚。2000年,德国学者Burmester等在Nature上首次报道,在人和小鼠脑内存在一种特异的携氧球蛋白—脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）。随后发现在大鼠、沙鼠等的脑内也存在Ngb表达。研究表明,Ngb可保护神经元对抗缺血/缺氧损伤,抑制神经元凋亡。Ngb过表达的转基因小鼠局灶性脑缺血后,脑梗体积减小;而应用反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides, AS-ODNs）抑制Ngb表达,脑缺血损伤加重。同时在细胞水平发现,应用Ngb小干扰RNA降低H2O2诱导的PC12细胞Ngb表达,加剧了细胞损伤。Ngb作为一种内源性保护蛋白,它的发现为缺血缺氧性脑病的研究提出了新思路。我室应用免疫组化技术初步研究发现LIP可上调大鼠海马Ngb表达,但LIP是否是通过上调Ngb表达来发挥抗脑缺血作用尚有待于进一步证实。研究发现,线粒体不仅在能量转换中扮演重要角色,在整合死亡信号刺激、决定细胞命运的过程中也起枢纽作用。线粒体成为脑缺血性损伤的亚细胞靶目标,在脑缺血/再灌注损伤和缺血预处理内源性脑保护中的作用越来越受到关注。资料显示,Ngb对神经元的保护作用可能与线粒体有关,如Ngb表达增加可改善H2O2诱导的PC12细胞线粒体膜电位的降低。线粒体介导的凋亡通路参与脑缺血后的细胞凋亡,凋亡信号的整合主要是通过Bcl-2家族蛋白在线粒体膜上的相互作用来实现的。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中已被发现的与细胞凋亡关系密切的两种基因,是一对在功能上相互对立的细胞凋亡调控基因。然而,LIP诱导的脑缺血耐受过程中,Ngb是否是通过调控线粒体的结构和功能及线粒体介导的凋亡途径等机制来发挥脑保护作用尚不清楚。因此,本实验应用大鼠四血管闭塞全脑缺血整体动物模型,观察Ngb在LIP诱导的脑缺血耐受中表达的变化、以及上调或阻断Ngb表达对LIP脑保护作用的影响,探讨Ngb在LIP抗脑缺血/再灌注损伤中的作用;在此基础上,从线粒体的结构和功能以及线粒体介导的凋亡途径等方面探讨Ngb在LIP诱导的脑缺血耐受中的线粒体机制;并进一步观察青年和老年大鼠脑缺血后海马CA1区Ngb表达的变化及LIP对其影响,以及LIP对正常大鼠海马CA1区Ngb表达的影响,为全面深入地评价脑缺血后海马Ngb表达的变化及LIP的保护作用提供实验依据,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新线索和思路。1 Ngb参与LIP诱导的大鼠脑缺血耐受目的:观察Ngb在LIP诱导的脑缺血耐受中表达的变化、以及应用Ngb诱导剂Hemin和Ngb AS-ODNs分别上调和抑制Ngb表达对LIP脑保护作用的影响,确定Ngb在LIP诱导的大鼠脑缺血耐受中的作用。1.1 LIP上调脑缺血大鼠海马CA1区Ngb表达动物分组及方法:雄性Wistar大鼠70只,随机分为5组:①脑缺血sham组（n=14）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉,但不夹闭。②LIP组（n=14）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次。③脑缺血组（n=14）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血。④LIP sham+脑缺血组（n=14）:游离双侧股动脉,但不夹闭,持续60min,之后行全脑缺血8min。⑤LIP+脑缺血组（n=14）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次,其余同第③组。每组14只动物,用于3个指标的观察。①海马CA1区Ngb mRNA表达（n=3）:于脑缺血sham手术或LIP或脑缺血后3 h取材,行RT-PCR检测;②海马CA1区Ngb蛋白表达（n=5）:于脑缺血sham手术或LIP或脑缺血后6 h取材,行Western blot检测;③海马CA1区锥体神经元迟发性死亡（delayed neuronal death,DND）（n=6）:于脑缺血sham手术或LIP或脑缺血后7 d取材,行硫瑾染色,在光学显微镜下观察海马CA1区组织形态,确定神经元密度（neuronal density,ND）（计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数6个区段,取平均数为神经元密度）和组织学分级（histological grade,HG）（0级:无神经元死亡;Ⅰ级:散在的神经元死亡;Ⅱ级:成片的神经元死亡;Ⅲ级:几乎全部的神经元死亡）。结果:RT-PCR和Western blot分析显示,脑缺血sham组海马CA1区Ngb mRNA和蛋白有一定的表达。与脑缺血sham组相比,LIP组Ngb mRNA和蛋白表达明显增加（P<0.05）。脑缺血组海马CA1区Ngb mRNA和蛋白表达较脑缺血sham组明显下降（P<0.05）。与脑缺血sham组和脑缺血组相比,LIP+脑缺血组Ngb mRNA和蛋白表达明显增加（P<0.05）,而LIP sham+脑缺血组Ngb表达则无明显变化。硫瑾染色结果显示, LIP组大鼠海马CA1区锥体神经元无明显损伤,神经元排列整齐,轮廓完整,核饱满而核仁清晰,其HG及ND与脑缺血sham组相比无差异。脑缺血组大鼠海马CA1区DND明显,与脑缺血sham组和LIP组相比,HG显著升高,ND显著下降（P<0.05）。在LIP+脑缺血组,上述损伤被明显抑制,表现为与脑缺血组相比,HG明显降低,ND明显升高（P<0.05）;而LIP sham+脑缺血组海马CA1区组织学特征则与脑缺血组无明显差异。这些结果表明,LIP具有抗脑缺血引起的海马CA1区DND的作用。上述结果表明,LIP可诱导脑缺血耐受,同时上调脑内Ngb的表达。1.2 Hemin上调Ngb表达诱导脑缺血耐受动物分组及方法:选用永久凝闭双侧椎动脉的雄性Wistar大鼠84只,随机分为:①脑缺血sham组（n=14）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉,但不夹闭。②脑缺血组（n=14）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8min致全脑缺血。③Hemin溶剂+脑缺血组（n=14）:腹腔注射Hemin溶剂持续2 d,每天1次,其余同第②组。④Hemin+脑缺血组（n=42）:腹腔注射Hemin持续2 d,每天1次,其余同第②组;根据Hemin的剂量,将该组进一步分为10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg三个亚组。每组14只动物,用于3个指标的观察。①海马CA1区Ngb mRNA表达（n=3）:于脑缺血sham手术或脑缺血后3 h取材,行RT-PCR检测;②海马CA1区Ngb蛋白表达（n=5）:于脑缺血sham手术或脑缺血后6h取材,行Western blot检测;③海马CA1区锥体神经元DND（n=6）:于脑缺血sham手术或脑缺血后7d取材,行硫瑾染色,在光学显微镜下观察海马CA1区组织形态,确定ND和HG。结果:RT-PCR和Western blot分析显示,与脑缺血sham组相比,脑缺血组和Hemin溶剂+脑缺血组海马CA1区Ngb mRNA和蛋白表达显著下降（P<0.05）。与脑缺血组和Hemin溶剂+脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组Ngb mRNA和蛋白表达显著增加,尤以20 mg/kg和40 mg/kg组明显（P<0.05）,并呈现剂量依赖性。硫瑾染色结果显示,与脑缺血sham组相比,脑缺血组大鼠海马CA1区锥体神经元有明显DND,HG明显升高,而ND则明显下降（P<0.05）。与脑缺血组相比,Hemin溶剂+脑缺血组HG和ND无明显差异。在Hemin+脑缺血组,DND被明显抑制,表现为与脑缺血组和Hemin溶剂+脑缺血组相比,HG明显降低,ND明显升高,并与Hemin的剂量呈现依赖性（P<0.05）。上述结果表明,Hemin可上调Ngb表达而诱导脑缺血耐受。1.3 Ngb AS-ODNs抑制LIP抗脑缺血引起的海马CA1区DND的作用动物分组及方法:选用永久凝闭双侧椎动脉的雄性Wistar大鼠55只,随机分为:①ACSF+LIP+脑缺血组（n=11）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌流10 min,反复3次,然后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血;LIP前右侧脑室注射ODNs的溶剂人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF） 2次,每天1次,每次8μl。②S-ODNs+LIP+脑缺血组（n=11）:LIP前右侧脑室注射1.6 nmol Ngb S-ODNs溶液2次,每天1次,每次8μl,其余同第①组。③AS-ODNs+LIP+脑缺血组（n=33）:LIP前右侧脑室注射Ngb AS-ODNs溶液2次,每天1次,每次8μl,其余同第①组。根据AS-ODNs的用量,进一步分为0.4 nmol、0.8 nmol和1.6 nmol三个亚组。每组11只动物,用于2个指标的观察。①海马CA1区Ngb蛋白表达（n=5）:于脑缺血后6h取材,行Western blot检测;②海马CA1区锥体神经元DND（n=6）:于脑缺血后7d取材,行硫瑾染色,在光学显微镜下观察海马CA1区组织形态,确定ND和HG。结果:Western blot分析显示,与ACSF+LIP+脑缺血组相比, AS-ODNs+LIP +脑缺血组海马CA1区Ngb蛋白表达显著降低（P<0.05）,并与AS-ODNs的剂量呈现依赖性,而LIP前侧脑室注射S-ODNs,对CA1区Ngb蛋白表达无明显影响。硫瑾染色结果显示,ACSF+LIP+脑缺血组和S-ODNs+LIP+脑缺血组,大鼠海马CA1区未见明显锥体神经元损伤,锥体神经元排列较整齐,轮廓完整,核饱满而核仁清晰。而AS-ODNs+LIP+脑缺血组CA1区锥体神经元损伤明显,并与AS-ODNs的剂量呈现依赖性。AS-ODNs 0.4 nmol组HG变化不明显,但ND明显降低（P<0.05）;AS-ODNs 0.8 nmol和1.6 nmol组,HG明显增高,ND明显降低（P<0.05）,表明Ngb AS-ODNs通过抑制Ngb表达,降低了LIP的脑保护作用。上述结果表明,Ngb AS-ODNs可阻断Ngb表达,进而阻断LIP的脑保护作用。1.4 LIP和Hemin降低脑缺血引起的血清Ngb蛋白含量增加动物分组及方法:雄性Wistar大鼠30只,随机分为6组:①脑缺血sham组（n=5）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉,但不夹闭。②LIP组（n=5）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次。③脑缺血组（n=5）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血。④LIP+脑缺血组（n=5）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次,其余同第③组。⑤Hemin+脑缺血组（n=5）:腹腔注射Hemin 20 mg/kg/d,持续2 d,其余同第③组。⑥Hemin溶剂+脑缺血组（n=5）:腹腔注射Hemin溶剂持续2 d,其余同第③组。每组5只动物,用于检测血清Ngb蛋白含量:于脑缺血sham手术或LIP或脑缺血后6 h取血,行ELISA检测。结果:ELISA显示,脑缺血sham组和LIP组血清Ngb蛋白含量较低,二者之间无统计学差异。与脑缺血sham组相比,脑缺血组血清Ngb蛋白含量显著增加（P<0.05）。而脑缺血前给予LIP预处理,血清Ngb蛋白含量明显下降（P<0.05）。与脑缺血组相比,Hemin（20 mg/kg）+脑缺血组血清Ngb蛋白含量明显下降（P<0.05）;而Hemin溶剂+脑缺血组血清Ngb蛋白含量无明显变化。以上结果表明,LIP和Hemin可明显降低脑缺血后血清Ngb蛋白含量升高。2 Ngb通过线粒体机制参与LIP诱导的脑缺血耐受目的:通过观察Ngb表达增加对海马CA1区神经细胞线粒体膜电位、线粒体Na+-K+-ATP酶活性、神经元及线粒体超微结构、Bcl-2和Bax mRNA表达的影响,探讨Ngb是否通过线粒体机制参与LIP诱导的脑缺血耐受。动物分组及方法:选用永久凝闭双侧椎动脉的雄性Wistar大鼠126只,随机分为:①脑缺血sham组（n=18）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉,但不夹闭。②脑缺血组（n=18）:永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血。③LIP+脑缺血组（n=18）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次,其余同第②组。④AS-ODNs+LIP+脑缺血组（n=18）:LIP前右侧脑室注射0.8 nmol Ngb AS-ODNs溶液2次,每天1次,每次8μl,其余同第③组。⑤S-ODNs+LIP+脑缺血组（n=18）:LIP前右侧脑室注射0.8 nmol Ngb S-ODNs溶液2次,每天1次,每次8μl,其余同第③组。⑥Hemin+脑缺血组（n=18）:脑缺血前腹腔注射20mg/kg Hemin 2次,每天1次,其余同第②组。⑦Hemin溶剂+脑缺血组（n=18）:脑缺血前腹腔注射Hemin溶剂2次,每天1次,其余同第②组。每组18只动物,用于4个指标的观察。①海马CA1区神经细胞线粒体膜电位（n=3）:于脑缺血sham手术或脑缺血后24 h取材,行流式细胞检测;②海马CA1区线粒体Na+-K+-ATP酶活性（n=10）:于脑缺血sham手术或脑缺血后6 h和24 h取材、检测;③海马CA1区Bcl-2和Bax mRNA表达（n=3）:于脑缺血sham手术或脑缺血后24 h取材,行RT-PCR检测;④海马CA1区神经元及线粒体超微结构（n=2）:于脑缺血sham手术或脑缺血后3 d取材,行透射电镜观察。结果:流式细胞仪检测神经细胞线粒体膜电位显示,脑缺血sham组海马CA1区神经细胞线粒体膜电位较高。与脑缺血sham组相比,脑缺血后线粒体膜电位显著降低（P<0.05）。与脑缺血组相比,LIP+脑缺血组线粒体膜电位明显增加（P<0.05）。与LIP+脑缺血组相比,AS-ODNs+LIP+脑缺血组线粒体膜电位显著降低,而S-ODNs+LIP+脑缺血组则无明显变化。与脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组线粒体膜电位明显增高（P<0.05）,而Hemin溶剂+脑缺血组则无明显变化。海马CA1区线粒体Na+-K+-ATP酶活性测定显示,在6 h时间点,脑缺血sham组该酶活性较高,而脑缺血后则较脑缺血sham组明显下降（P<0.05）。与脑缺血组相比,LIP+脑缺血组该酶活性明显下降（P<0.05）。与LIP+脑缺血组相比,AS-ODNs+LIP+脑缺血组该酶活性显著增加（P<0.05）,而LIP前侧脑室注射Ngb S-ODNs,对该酶活性无影响。与脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组该酶活性明显降低（P<0.05）,而Hemin溶剂+脑缺血组则无明显变化。在24 h时间点,脑缺血sham组线粒体Na+-K+-ATP酶活性较高。与脑缺血sham组相比,脑缺血后该酶活性显著下降（P<0.05）。与脑缺血组相比,LIP+脑缺血组该酶活性明显增加（P<0.05）。与LIP+脑缺血组相比,AS-ODNs +LIP+脑缺血组该酶活性显著降低（P<0.05）,而S-ODNs +LIP+脑缺血组则无明显变化。与脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组该酶活性明显增加（P<0.05）,而Hemin溶剂+脑缺血组则无明显变化。RT-PCR结果显示,脑缺血sham组海马CA1区Bcl-2和Bax mRNA表达较低。与脑缺血sham组相比,脑缺血组Bcl-2和Bax mRNA表达均显著增加,而Bax增加更为明显（P<0.05）。与脑缺血组相比,LIP+脑缺血组Bcl-2 mRNA表达明显增加（P<0.05）,而Bax mRNA表达明显下降（P<0.05）。与LIP+脑缺血组相比,AS-ODNs+LIP+脑缺血组Bcl-2 mRNA表达明显下降（P<0.05）,Bax mNRA表达增加（P<0.05）;而在LIP预处理前侧脑室注射Ngb S-ODNs干预,Bcl-2和Bax mRNA表达无明显变化。与脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组Bcl-2 mRNA表达明显增加（P<0.05）,而Bax mRNA表达下降（P<0.05）;而Hemin溶剂+脑缺血组Bcl-2和Bax mRNA表达无明显变化。透射电镜结果显示,①脑缺血sham组:海马CA1区神经元形态完整,结构清晰,核膜完整,核形态正常,胞质中细胞器丰富。胞质内有丰富的线粒体,呈圆形或椭圆形,嵴较多而清晰可见。②脑缺血组:海马神经元严重水肿变形。细胞核不规则,核膜皱缩,胞质高度水肿,细胞器数量明显减少。线粒体呈气球样肿胀,大量空泡化,嵴断裂,溶解,消失,同时有的线粒体致密化。③LIP+脑缺血组:与脑缺血组相比,LIP+脑缺血组神经元和线粒体损伤明显减轻。表现为神经元水肿明显减轻,核膜尚完整,核形态正常,染色质均匀分布,细胞器尚丰富。胞质内有丰富的线粒体,大多数线粒体嵴完整,排列紧密规律,基质颗粒极少量脱落,少量线粒体水肿,空泡化。④AS-ODNs+LIP+脑缺血组:与LIP+脑缺血组相比,AS-ODNs+LIP+脑缺血组神经元和线粒体损伤明显加重,但较脑缺血组损伤稍轻些。神经元明显水肿,细胞器数量明显减少。线粒体水肿、变形,部分膜溶解,同时有的线粒体致密化。⑤S-ODNs+LIP+脑缺血组:本组与LIP+脑缺血组比较,无显著差别。⑥Hemin+脑缺血组:与脑缺血组相比,Hemin+脑缺血组神经元和线粒体的损伤明显改善。神经元水肿明显减轻,核膜尚完整,核形态正常,细胞器尚丰富。胞质内有丰富的线粒体,多数线粒体嵴完整,排列紧密规律,基质颗粒极少量脱落,少量线粒体轻度水肿,或致密化。⑦Hemin溶剂+脑缺血组:本组与脑缺血组比较,无显著差别。以上结果表明,Ngb表达增加可通过调控海马CA1区神经细胞线粒体膜电位、Na+-K+-ATP酶活性、线粒体超微结构、Bcl-2和Bax mRNA表达等线粒体机制参与LIP诱导的脑缺血耐受。3青年和老年大鼠脑缺血后海马CA1区Ngb表达的变化及LIP对其影响目的:观察比较青年和老年大鼠脑缺血时海马CA1区Ngb表达的变化及LIP对其影响,为进一步评价脑缺血后海马Ngb表达的变化及LIP的保护作用提供实验依据。动物分组及方法:选用3月龄健康雄性Spague-Dawley大鼠30只,2123月龄健康雄性Spague-Dawley大鼠30只。将凝闭双侧椎动脉2 d的青年和老年大鼠均随机分为脑缺血组和LIP+脑缺血组。脑缺血组:夹闭双侧颈总动脉8 min;LIP+脑缺血组:夹闭双侧股动脉10 min,再灌流10 min,反复3次,随后夹闭双侧颈总动脉8 min。每组15只动物,用于3个指标的观察。①海马CA1区Ngb mRNA表达（n=3）:于脑缺血后3 h取材,行RT-PCR检测;②海马CA1区Ngb蛋白表达（n=6）:于脑缺血后6h取材,行Western blot检测;③海马CA1区锥体神经元DND（n=6）:于脑缺血后7d取材,行硫瑾染色,在光学显微镜下观察海马CA1区组织形态,确定ND和HG。结果:RT-PCR分析显示,Ngb和GAPDH扩增后的产物片段与设计相符。老年脑缺血组Ngb mRNA表达比青年脑缺血组明显降低（P<0.05）。LIP可明显上调青年和老年大鼠脑缺血后Ngb的mRNA表达（P<0.05）,但老年大鼠（LIP+老年脑缺血组）的上调幅度小于青年大鼠（LIP +青年脑缺血组）（P<0.05）。Western blot结果显示,各组均可在分子量相当于17KD和42KD的区域见Ngb和β-actin蛋白表达条带。Ngb蛋白表达在老年大鼠脑缺血组比青年大鼠脑缺血组显著降低（P<0.05）,LIP后青年和老年脑缺血大鼠Ngb的蛋白表达均明显上调（P<0.05）,但老年大鼠（LIP+老年脑缺血组）的上调幅度小于青年大鼠（LIP +青年脑缺血组）（P<0.05）。硫瑾染色显示,青年脑缺血组有明显的组织损伤,表现为海马CA1区锥体细胞稀疏,排列紊乱,多数细胞胞核固缩,核仁欠清晰,尼氏小体减少或消失。老年脑缺血组海马CA1区锥体细胞几乎全部固缩或缺失,与青年脑缺血组相比ND显著下降（P<0.05）,表明脑缺血后,老年大鼠的损伤比青年大鼠更严重。LIP+青年脑缺血组CA1区锥体细胞排列整齐致密,胞核饱满,核仁较清晰,仅个别锥体细胞胞核固缩或缺失,和青年脑缺血组相比,HG显著降低（P<0.05）,ND明显升高（P<0.05）。LIP+老年脑缺血组与老年脑缺血相比,组织损伤明显减轻,部分锥体细胞固缩或缺失,HG显著降低（P<0.05）,ND明显升高（P<0.05）;但与LIP+青年脑缺血组比较,CA1区锥体细胞固缩或缺失仍较多,ND明显降低（P<0.05）,表明LIP可减轻脑缺血损伤,但老龄降低了LIP的保护作用。以上结果表明,老年大鼠全脑缺血后Ngb的表达及LIP对其上调作用较青年大鼠明显减弱,这可能是老年大鼠脑缺血后损伤较重和LIP对老年大鼠脑缺血保护作用较弱的原因之一。4 LIP上调正常大鼠海马CA1区Ngb表达目的:观察LIP后不同时间点正常大鼠海马CA1区Ngb表达的变化,为研究和评价LIP对正常机体的脑保护作用提供实验依据。动物分组及方法:雄性Wistar大鼠40只随机分为:①sham组（n=8）:游离双侧股动脉,但不夹闭。②LIP组（n=32）:夹闭双侧股动脉10 min,再灌10 min,反复3次。以上动物于sham手术后30 min或LIP后30 min、1 h、3 h和6 h取材, RT-PCR检测海马CA1区Ngb mRNA表达（n=3）,于sham手术后1 h或LIP后1 h、6 h、12 h和1 d取材,Western blot分析检测Ngb蛋白表达（n=5）。结果:RT-PCR分析显示,在150bp和349bp处分别为Ngb和内参GAPDH的扩增条带。Sham组海马CA1区有一定的Ngb mRNA表达。与sham组相比,LIP后海马CA1区Ngb mRNA表达增加。这种增加于LIP后30 min最明显（P<0.05）,随后逐渐下降,在6 h时接近sham组水平。Western blot结果显示,各组均可在分子量相当于17KD和42KD的区域分别出现Ngb和β-actin蛋白表达条带。Sham组海马CA1区有一定的Ngb蛋白表达。与sham组相比,LIP后海马CA1区Ngb蛋白表达增加。这种增加于LIP后1 h达到高峰（P<0.05）,随后逐渐下降,至1 d时接近sham组。以上结果表明,LIP能上调正常大鼠海马CA1区Ngb mRNA和蛋白表达,Ngb mRNA表达高峰早于蛋白表达高峰。5结论⑴LIP能明显上调脑缺血大鼠海马CA1区Ngb mRNA和蛋白表达,同时LIP可明显抑制脑缺血后CA1区锥体神经元DND,降低血清Ngb蛋白含量;腹腔注射Ngb诱导剂Hemin能模拟LIP诱导的脑缺血耐受,而侧脑室注射Ngb AS-ODNs可部分阻断LIP的脑保护作用。这些结果表明,Ngb表达上调在LIP诱导脑缺血耐受中发挥重要作用。⑵Ngb表达增加通过增加线粒体膜电位、改善线粒体Na+-K+-ATP酶活性、保护线粒体超微结构、调节Bcl-2和Bax mRNA表达等线粒体机制参与LIP诱导的脑缺血耐受。⑶老年大鼠全脑缺血后Ngb的表达及LIP对其上调作用较青年大鼠明显减弱,这可能是老年大鼠脑缺血后损伤较重和LIP对老年大鼠脑缺血保护作用较弱的原因之一。⑷LIP可上调正常大鼠海马CA1区Ngb表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 脑红蛋白在肢体缺血预处理脑保护中的作用及其机制
• 引言
• 第一部分 Ngb 参与LIP 诱导的大鼠脑缺血耐受
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 Ngb 通过线粒体机制参与LIP 诱导的脑缺血耐受
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 青年和老年大鼠脑缺血后海马Ngb 表达的变化及LIP 对其影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 LIP 上调正常大鼠海马CA1 区Ngb 表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 线粒体在脑缺血和缺血预处理内源性脑保护中的作用
• 致谢
• 个人简历