论文摘要
家禽传染性疾病是养禽业最大的威胁,给养殖业造成严重经济损失。应用传统免疫预防手段仍存在一些问题,如弱毒疫苗的潜在安全问题;灭活疫苗虽然安全有效,但免疫效力尤其细胞免疫作用受限制;基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗等虽具有应用潜力,但也需提高其免疫,尤其是细胞免疫效果。 IL-18是一种强有力IFN-γ诱导剂,具有重要的免疫调节功能,自发现以来一直是细胞因子研究中的热点之一,可望成为疫苗的一种重要的细胞免疫佐剂,以提高机体抗感染力,增强灭活苗或基因工程疫苗免疫效果。 本研究参照GenBank已发表的ChIL-18基因序列,在其编码区两侧设计一对引物,以丝裂原PHA活化的河南大面积饲养的60日龄固始鸡k系、固始鸡纯系及海兰鸡等几个品种鸡的脾淋巴细胞中提取的总RNA为模板,RT-PCR均扩增出大小约600bp的基因片段,并把它克隆到pGEM-T Easy Vector上,构建重组质粒pGEM-ChIL-18,经PCR、酶切鉴定及DNA测序验证,该基因为ChIL-18全基因,比较表明:3个品种ChIL-18全基因序列及推导氨基酸序列均为597bp,含一个开放阅读框,编码198个氨基酸,N端前29个氨基酸为信号肽序列,与Schneider等（2000）报告的ChIL-18基因序列基本符合;IL-18基因存在种的多样性,亲缘关系越近同源性越高,为其作为免疫佐剂应用于预防接种的研究奠定了基础。 在此基础上,我们把从pGEM-ChIL-18上获得的编码鸡IL-18成熟蛋白（mChIL-18）基因用EcoR Ⅰ+SalI双酶切,亚克隆到同样双酶切的大肠杆菌原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-mChIL-18,经PCR、酶切鉴定并进行确证性序列测定,结果表明,将mChIL-18的基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1的目的位点。重组质粒pGEX-mChIL-18转化受体菌BL21（DE3）,然后用IPTG诱导,经SDS-PAGE电泳显示,表达的mChIL-18融合蛋白分子量约为49kDa,用0.6mmoL·L-1IPTG于37℃诱导4h表达产物最佳,占总菌体蛋白约20.1%。pGEX-mChIL-18表达产物经分离、纯化、复性,并对其生物学活性进行初步试验,多采用鸡T淋巴细胞转化试验（MTT法）,检测表明,mChIL-18具有明显促进鸡T细胞转化的生物学活性,为今后进一步进行mChIL-18的生物学功能研究及其应用奠定了基础。 与人和哺乳动物比较,鸡IL-18的研究相对来说比较滞后,利用体外表达技术研制重组mChIL-18蛋白以及抗鸡IL-18的多克隆和单克隆抗体并以此作为工具进行ChIL-18蛋白的生物学特性、免疫调节作用及其在比较免疫学中作用的研究具有重要的意义。