FK506抑制神经钙调蛋白改善颞叶癫痫病程和记忆学习能力的实验研究

论文摘要

研究背景癫痫（Epilepsy,EP）是一常见病,多发病。据流行病学调查,人群患病率为5‰～6‰,严重危害人类健康,影响人们生活质量,致残、致死率较高。其中约有20%的颞叶癫痫发作难于用药物控制,成为难治性（顽固性）癫痫,多与颞叶内侧海马硬化有关。大量颞叶癫痫病人和颞叶癫痫动物模型的研究均已证实,颞叶癫痫根据其发作的程度和持续时间不同,可诱发不同程度的神经细胞变性损伤。如果这种损伤是不可逆的,则可导致永久的神经细胞损伤和癫痫易感性增强。同时,癫痫又可导致钙离子大量释放,激活神经钙调蛋白（calcineurin,CaN）,进而加重线粒体功能紊乱和神经元死亡,形成级联损伤反应,引起难治性癫痫和记忆、学习等认知功能障碍。CaN也称钙调神经磷酸酶,为丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,为目前唯一所知的一种活性受Ca2+调节的蛋白磷酸酶。当胞浆内钙增高时,可激活CaN,发挥蛋白脱磷酸化作用,调节许多分子过程。CaN在T淋巴细胞中含量特别丰富,在心脏及骨骼肌中也有较高表达,尤其在中枢神经系统的几个特定的区域大量表达,如脑皮质,纹状体,黑质,小脑和海马,而这些区域非常容易受缺血影响,且对兴奋神经毒素高度敏感。在神经元中,CaN大部分存在于突触后密集区和胞体,为丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,是目前唯一所知的一种活性受Ca2+/CaM调节的蛋白磷酸酶。当胞浆内钙增高时,可激活CaN,发挥蛋白脱磷酸化作用。已知CaN在Ca2+信号转导过程中发挥非常重要的功能,它既是效应酶,也是调节酶。参与多种细胞内信号反应及细胞凋亡等病理过程,如调节学习和记忆,参与长时程记忆,调节神经递质传递和细胞凋亡,抑制GABA受体脱磷酸化,调节基因转录和细胞骨架形成等。目前,CaN在癫痫发作中的作用已有少量报道,但是CaN在颞叶癫痫中的作用机制却不十分清楚,对颞叶癫痫发作及其引起的认知功能障碍的预防和治疗也缺乏有效手段。FK506是一种高效免疫抑制剂,目前临床上广泛用于控制器官移植后的排斥反应,它通过与FK506结合蛋白12（FKBP12）相结合,抑制CaN的活性来发挥生物学作用。近年来研究发现,FK506尚具有免疫抑制作用以外的神经营养和神经保护作用。Furuichi等在大鼠脑缺血模型中发现FK506有神经保护作用,不仅可缩小梗死面积,还能减轻因神经细胞凋亡所致的功能丧失。在海人酸诱导的癫痫模型中,FK506可阻止芽孢再生而具有神经保护作用。尽管FK506在缺血和癫痫动物实验模型中有保护作用,但作用机制国内外均未见报道。到目前为止,海马区CaN的表达与颞叶癫痫之间有何关系,以及CaN抑制剂FK506在颞叶癫痫的作用机制仍未见报道。本研究建立红藻氨酸（kainic acid,KA）诱导的大鼠颞叶癫痫模型,应用行为学方法检测颞叶癫痫发作情况以及导致的认知功能障碍;应用Timm染色和免疫组化观察苔丝纤维发芽和酸性胶质蛋白变化;应用电子透镜检测颞叶癫痫造成的神经元线粒体损害并观察免疫抑制剂FK506的作用;应用海马切片全细胞膜片钳方法记录CA3区锥体神经元抑制性突触后电流（IPSC）频率、波幅变化以及免疫抑制剂FK506和雷帕霉素对锥体神经元IPSC频率和波幅变化的影响,探索IPSC形成机制;应用分光光度法法测定基础状态和Mg2+最大刺激状态下CaN磷酸酶活性在癫痫发作后不同时间的动态变化;应用Westblot方法检测CaN蛋白表达的动态变化并判断CaN活性与CaN蛋白表达的关系,检测GABAAR和GABAARβ2/3亚单位磷酸化蛋白表达变化以及FK506和雷帕霉素的干预作用。发现颞叶癫痫发作可造成苔丝纤维发芽、胶质细胞增生和线粒体破坏;首次在活体动物水平和活体外细胞水平证实CaN参与颞叶癫痫发作的病程。发现CaN活性在癫痫早期就明显升高,而CaN蛋白在癫痫发作后24小时才出现表达,但二者均可促进GABAAR脱磷酸化,下调IPSC,使IPSC频率和波幅明显降低,从而提高了癫痫易感性,导致难治性癫痫形成。免疫抑制剂雷帕霉素并不能逆转IPSC波幅和频率的降低,而另一免疫抑制剂FK506,为CaN抑制剂,可通过抑制CaN活性和CaN蛋白表达,抑制GABAAR脱磷酸化,逆转IPSC波幅和频率的降低,从而降低了癫痫的易感性,抑制颞叶癫痫长期反复发作,逆转神经元损害,改善认知功能障碍。本研究为CaN抑制剂在临床的应用提供了可靠地理论依据。本研究分为三部分:第一部分:立体定向侧脑室海人酸注射诱导颞叶癫痫大鼠模型的建立及脑电、病理学观察目的:立体定向海人酸（KA）侧脑室注射诱导颞叶癫痫大鼠模型,观察致痫过程中大鼠行为学的改变;利用皮层电极观察大鼠脑电变化;从病理学方面研究海马神经元损伤的变化、苔丝纤维发芽及胶质细胞形成情况,探讨KA致痫机制。方法:1.应用立体定位侧脑室注射给药的方法建立KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型。随机分为对照组（生理盐水组）、KA诱导的颞叶癫痫引起癫痫持续状态后2h（SE2h）组、7d（SE7d）组、45d（SE45d）组。2.根据Racine分级观察大鼠癫痫发作行为变化,记录癫痫发作次数、发作程度以及持续时间。3.利用生物机能记录仪监测大鼠致痫后24h内、7d,45d皮层脑电变化情况。4.应用Nissl染色法观察致痫后2h,7d和45d大鼠海马神经元的形态及数目改变。6.应用Timm染色法观察致痫后2h,7d和45d大鼠海马神经元苔藓纤维出芽（mossy fiber,MF）状况和数目改变。7.应用免疫组化法观察致痫后2h,7d和45d大鼠海马神经元GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞数目改变。结果:1.KA注射后大鼠表现典型的颞叶癫痫发作,开始发作程度较轻,逐渐加重直至癫痫持续状态,以后发作逐渐停止,但15天后仍见不同程度癫痫发作。发作分为急性期,静止期和慢性期。大鼠死亡率为10%。2.KA注射后大鼠双侧皮层可见丛集性棘波放电,并逐渐增多,发展成爆发性连续性棘波发放,以后逐渐减少。模型建立后1～15d,脑电图未见异常。15d至2个月,大脑皮层可记录到较多的癫痫波。3.对照组大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富,未见明显神经元丢失坏死。KA组大鼠海马CA1、CA3区可见明显神经元丢失,SE2h即可出现神经元坏死,随着时间延长,神经元坏死更加明显。4.对照组大鼠海马齿状回内分子层,CA3区锥体细胞层达CA3区始层有极少数苔藓纤维穿过。KA组大鼠海马齿状回内分子层和CA3始层在急性期（SE2h）未见明显变化,静止期（SE7d）出现苔丝纤维（MF）发芽,慢性期发芽进行性增加（SE45d）。5.对照组大鼠、SE2h大鼠在海马区仅有弱的GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞。注射KA后大鼠至第7d阳性反应的星形胶质细胞的数量逐渐增多,45d时阳性反应的星形胶质细胞的数量明显增多。结论:1.海人酸侧脑室注射可以成功诱发大鼠颞叶癫痫,该法操作简便,安全性好,痫鼠存活率高,致痫过程清晰,根据大鼠行为学和EEG改变可分为急性期（SE发作）、静息期和慢性期（SRS阶段）。因此海人酸致痫模型可作为癫痫发生机制研究的理想模型。2.海人酸致痫后可造成海马神经元损伤和苔藓纤维出芽（MF）。主要表现为神经元变性、死亡,细胞结构瓦解;GFAP标记的星形胶质细胞水肿、增生,胶质瘢痕形成,海马萎缩;齿状回内分子层和CA3区始层出现密集的深染颗粒,形成浓密的条带。第二部分:FK506改善颞叶癫痫病程及学习记忆能力的实验研究目的:研究免疫抑制剂FK506是否能改善颞叶癫痫的病程、提高颞叶癫痫鼠学习记忆能力;是否对癫痫发作造成的线粒体超微结构损害有保护作用,从而为临床应用提供理论依据。方法:1.应用立体定位侧脑室注射给药的方法建立KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型。实验动物随机分为对照组、KA组、FK506预防组（造模前30分应用FK506）和FK506治疗组（造模后30分应用FK506）。2.根据Racine分级观察大鼠癫痫发作行为变化,记录癫痫发作次数、发作程度以及持续时间并观察应用FK506后癫痫行为的改变。3.应用水迷宫实验方法观察致痫大鼠认知功能的变化,并观察应用FK506后认知功能改善情况。4.应用Nissl染色观察各组大鼠癫痫反复发作后海马神经元的形态及数目改变并观察FK506的作用。5.电子透镜观察各组大鼠癫痫反复发作后海马神经元线粒体改变并观察FK506对线粒体的作用。结果:1.KA注射后大鼠表现典型的颞叶癫痫发作,开始发作程度较轻,逐渐加重直至癫痫持续状态,以后发作逐渐停止。与KA组大鼠比较,FK506预防组和FK506治疗组癫痫发作次数与癫痫发作最大程度持续时间均明显减少。2.Morris水迷宫（Morris water maze）实验检测显示KA组大鼠认知功能障碍明显,发现平台的潜伏期明显延长,在目标象限游泳的距离和次数明显缩短。对照组,FK506预防组和FK506治疗组大鼠的认知功能未见明显区别。提示FK506可提高颞叶癫痫鼠记忆学习能力。3.对照组,神经元着蓝色,深染,神经元排列致密整齐,细胞大而圆,核位于中央,尼氏小体位于胞浆。KA注射后,可见CA1、CA3区神经元排列紊乱,细胞大量丢失,神经元数量减少,只剩下浓染的细胞碎片,仅见少量的存活细胞,胞体缩小,核固缩,病变级别为3.91±0.22和4.21±0.52级,同假手术组相比,差异均有统计学意义（均p＜0.01）。FK506预防组,CA1、CA3区神经元数量较多,层次较致密但不紊乱,细胞大而圆,可见细胞核深染,仅见少量细胞碎片和细胞浆浓染,神经元病变级别为2.51±0.18和2.92±0.33,同KA组比较,差异均有统计学意义（均p＜0.05）;FK506治疗组病变级别为2.85±0.31和3.14±0.27,同KA组比较,差异均有统计学意义（均p＜0.05）。提示FK506对KA引起的神经元变性、坏死有保护作用。4.电镜下KA组CA1、CA3区可见细胞皱缩,核膜局部崩解,胞质内有大量高密度小体积脂肪滴,残存的神经元尼氏小体明显减少,线粒体肿胀、破碎,整个膜系统出现明显破坏,神经细胞呈现严重的坏死改变,线粒体主要表现为3、4级损伤,病变级别为3.89±1.02和4.05±0.26级,同对照组相比,差异均有统计学意义（均p＜0.01）。FK506预防组电镜下可观察到大鼠的线粒体间隙肿胀（尤其是嵴部分）,基质密度降低,线粒体损伤以1、2级为主,病变级别为1.65±0.11和1.78±0.21级;FK506治疗组可观察到大鼠的线粒体有不同程度的损伤,但膜的结构尚完整,线粒体的改变以2、3级为主,FK506治疗组病变级别为2.01±1.33和2.26±0.61级。预防组、治疗组与KA组相比,差异均有统计学意义（均p＜0.05）。提示FK506对KA引起的海马神经元线粒体的损伤有保护作用。结论:1.KA注射后大鼠表现典型的颞叶癫痫发作,开始发作程度较轻,逐渐加重直至癫痫持续状态,以后发作逐渐停止,但15天后仍见不同程度癫痫发作,2.FK506改善KA诱导的颞叶癫痫病程,明显降低癫痫敏感性,使癫痫发作次数明显减少,癫痫最大程度持续时间明显缩短。3.KA诱导的颞叶癫痫大鼠,学习记忆能力明显降低;FK506可缩短发现平台的潜伏期,提高目标象限游泳距离和次数。提示FK506有提高颞叶癫痫鼠学习和记忆能力作用。4.FK506可逆转KA诱导的颞叶癫痫大鼠海马神经元萎缩、坏死和线粒体的破坏,提示FK506对神经元变性有保护作用。第三部分FK506上调GABA能突触后膜抑制作用改善癫痫的实验研究目的:探讨颞叶癫痫发作后,海马CA3锥体神经元突触后膜抑制性电流（IPSC）的变化;观察癫痫发作后CaN活性、CaN蛋白表达、GABA受体表达的动态变化以及相互影响;研究CaN抑制剂FK506抗癫痫作用机制。方法:1.应用海人酸（KA）侧脑室注射方法制作大鼠颞叶癫痫模型。2.快速取KA组海马切片,用完整细胞膜片钳检测CA3区锥体神经元抑制性突触后电流（IPSC）的频率和波幅变化,水浴灌注免疫抑制剂FK506和雷帕霉素,观察二者对锥体神经元IPSC频率和波幅变化影响。3.分假手术组（对照组）、KA组、FK506预防组、FK506治疗组,观察FK506对颞叶癫痫病程的影响;然后取海马切片,应用对硝基苯酚磷酸盐脱磷酸化法和Westernblot分析方法测定基础和最大刺激状态下CaN磷酸酶活性和CaN蛋白表达在不同时间的动态变化。观察FK506对癫痫后CaN活性及CaN蛋白表达变化的影响。4.应用Westernblot分析方法,使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体,测定FK506对颞叶癫痫鼠GABAARβ2/3亚单位磷酸化状态影响。结果:1.癫痫发作后,CA3区锥体细胞IPSC频率和波幅明显降低,FK506通过抑制CaN活性提高IPSC频率和波幅,从而上调GABA能抑制作用:与假手术组比较,癫痫后CA3区锥体神经元IPSC的频率和幅度都明显降低,差异均有统计学意义。KA处理组IPSC平均频率降低53.4±3.7%（假手术组1.72±0.1 Hz,KA组0.80±5.6 Hz;n=5个细胞;p＜0.01）;平均波幅下降38.4±7.1%（假手术组19.8±2.1 pA,KA组12.2±1.2pA;p＜0.05;n=5个细胞）。水浴应用CaN抑制剂FK506（1μM）后,平均IPSC频率显著提高113.8±21.1%（从KA组0.80±0.5 Hz到FK506组1.71±0.11Hz,n=5个细胞,p＜0.01）;IPSC平均波幅明显增加48.4±4.1%（从KA组12.2±1.2 pA到FK506组18.1±0.2 pA,p＜0.05;n=5个细胞）,差异均有统计学意义。应用免疫抑制剂雷帕霉素后（非CaN抑制剂）,IPSC的频率和幅度分别是0.91±0.03 Hz和11.5±0.4 pA.与KA组比较,IPSC的平均频率和幅度没有明显变化,差异无统计学意义（均p＞0.05,n=5个细胞）,提示FK506是通过抑制CaN活性,提高IPSC的频率和幅度,从而上调GABA能抑制作用的。2.FK506抑制癫痫后海马区CaN的活性增强:KA处理组切片显示CaN磷酸酶活性在基础和最大刺激状态下明显增加。CaN平均基础活性KA组比假手术组增加56.54±3.25%（KA组是28.35±0.82 ug/ml,假手术组18.11±1.25 ug/ml,n=5;p＜0.01）,CaN平均最大活性KA组比假手术组增加62.5±1.05%（KA组是42.12±5.82ug/ml,假手术组25.92±3.85 ug/ml,n=5;p＜0.01）,差异均有统计学意义。同KA组相比,FK506预防组CaN平均基础活性和平均最大活性均明显降低,分别降低35.62%和38.70%（FK506预防组平均基础活性:18.25±1.15 ug/ml,n=6,p＜0.01;平均最大活性:25.82±2.91 ug/ml,n=6,p＜0.01）,差异均有统计学意义。FK506治疗组CaN平均基础活性和平均最大活性分别降低25.11%和49.6%（FK506治疗组平均基础活性:21.23±2.53 ug/ml,n=6,p＜0.01;平均最大活性:26.77±1.54 ug/ml,n=6,p＜0.01）,差异均有统计学意义。3.FK506对癫痫后海马CA3区CaN蛋白水平表达影响:在SE后2h、6h、12h各组CaN蛋白水平表达均没有明显变化,差异无显著性统计意义（均p＞0.05,n=5）,而在SE24h后,同假手术组（1.0±0.1,n=5）比较,KA组CaN蛋白表达明显增加（1.73±0.3倍,n=5,p＜0.05）,差异有显著性统计意义;同KA组比较,FK506预防和治疗组蛋白表达明显降低（分别是1.12±0.2倍,1.2±0.6倍,均p＜0.05,n=5）,差异均有显著性统计意义。提示FK506可抑制癫痫24h后CaN蛋白的表达,对慢性难治性癫痫有抑制作用。4.FK506抑制GABAA受体脱磷酸化:KA诱导的颞叶癫痫导致GABAA受体β2/3亚单位丝/苏氨酸残基脱磷酸化:在SE2h后,GABAARβ2/3亚单位的丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化水平明显下降,为假手术组的38.2±4.8%,差异有显著性统计意义（n=6;p＜0.001）;应用FK506可部分抑制GABAA受体脱磷酸化,提高丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化水平。FK506预防组和治疗组分别是假手术组的62.7±3.8%和59.3±2.5%,与KA组比较,差异均有统计学意义（n=6;p＜0.05）。但各组总GABAARβ2/3亚单位水平没有明显改变。提示FK506可逆转颞叶癫痫所致GABAA受体β2/3亚单位脱磷酸化,控制癫痫发作。结论:1.KA诱导的颞叶癫痫引起海马CA3区CaN活性升高和GABAA受体去磷酸化,导致了锥体神经元IPCS频率和波幅迅速降低,突触后膜抑制作用受到抑制,兴奋性升高,癫痫发作加重。免疫抑制剂FK506通过抑制CaN活性和CaN蛋白表达,提高基础突触抑制（IPCS频率和波幅升高）,上调GABAA受体抑制作用,调节了颞叶癫痫信号传导机制,部分抵消KA诱发的颞叶癫痫,改善癫痫病程。2.颞叶癫痫早期,CaN蛋白未见明显变化,癫痫后24小时CaN蛋白才开始表达。提示CaN活性的迅速增加不太可能是CaN蛋白表达迅速增加的结果,而是CaN活性增加或CaN活性动力学改变。而SE后24hCaN蛋白表达增加,提示颞叶癫痫敏感性升高,可能与长期慢性癫痫发作有关。CaN抑制剂FK506抑制癫痫早期CaN活性升高和癫痫后24小时CaN蛋白表达,为急慢性癫痫的治疗提供了理论依据。研究意义本研究建立红藻氨酸（kainic acid,KA）诱导的大鼠颞叶癫痫模型,应用行为学方法检测颞叶癫痫发作情况以及导致的认知功能障碍;应用Timm染色和免疫组化观察苔丝纤维发芽和酸性胶质蛋白变化;应用电子透镜检测颞叶癫痫造成的神经元线粒体损害并观察免疫抑制剂FK506的作用;应用海马切片全细胞膜片钳方法记录CA3区锥体神经元抑制性突触后电流（IPSC）频率、波幅变化以及免疫抑制剂FK506和雷帕霉素对锥体神经元IPSC频率和波幅变化的影响,探索IPSC形成机制;应用对硝基苯酚磷酸盐脱磷酸化法测定基础状态和Mg2+最大刺激状态下CaN磷酸酶活性在癫痫发作后不同时间的动态变化;应用Westblot方法检测CaN蛋白表达的动态变化并判断CaN活性与CaN蛋白表达的关系,检测GABAAR和GABAARβ2/3亚单位磷酸化蛋白表达变化以及FK506和雷帕霉素的干预作用。发现颞叶癫痫发作可造成苔丝纤维发芽、胶质细胞增生和线粒体破坏;首次在活体动物水平和活体外细胞水平证实CaN参与颞叶癫痫发作的病程。发现CaN活性在癫痫早期就明显升高,而CaN蛋白在癫痫发作后24小时才出现表达,但二者均可促进GABAAR脱磷酸化,下调IPSC,使IPSC频率和波幅明显降低,从而提高了癫痫易感性,导致难治性癫痫形成。免疫抑制剂雷帕霉素并不能逆转IPSC波幅和频率的降低,而另一免疫抑制剂FK506,为CaN抑制剂,可通过抑制CaN活性和CaN蛋白表达,抑制GABAAR脱磷酸化,逆转IPSC波幅和频率的降低,降低了癫痫的易感性,抑制颞叶癫痫长期反复发作,逆转神经元损害,改善认知功能障碍。本研究为CaN抑制剂对急慢性癫痫的治疗提供了可靠的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 立体定向海人酸诱导颞叶癫痫大鼠模型的建立及脑电、病理学观察
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 第二部分 FK506改善颞叶癫痫病程及学习记忆能力的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 第三部分 FK506上调GABA能突触后膜抑制作用改善癫痫的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文和科研课题
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文