金属离子对牛胰岛素淀粉样纤维形成的作用

论文摘要

在后基因组时代,越来越多的医学病理学研究都是从分子和亚分子水平进行的,其中,分子构象疾病的研究已经成为这方面的热门领域。分子构象疾病是由细胞内或者细胞外的蛋白质因错误折叠而导致的聚集引起的。当一种有特定功能的蛋白质在折叠过程中发生错误时,蛋白质的疏水残基或局域结构就会暴露于蛋白质分子表面,为减少疏水残基与溶剂分子之间相互作用,蛋白质分子开始聚集。疏水作用是蛋白质在折叠、去折叠和聚集过程中起主要作用的一种驱动力。在一些病例中,蛋白质聚集通常发生在细胞质外,并且形成纤维样形态,这就叫做淀粉样聚集。许多神经退行性疾病如阿尔兹海默疾病和海绵样疾病都与蛋白质淀粉样聚集有关。在一定的条件下,一些与疾病不相关的蛋白质也可以形成淀粉样纤维,如胰岛素等。所以,淀粉样纤维化是所有蛋白质的共性,与其序列和结构无关。研究蛋白质淀粉样纤维形成的环境条件和分子机制对于探索相关疾病的病因和治疗方法具有重要的意义。胰岛素是动物胰脏中胰岛β-细胞所分泌的一种调节糖代谢的激素,由两条富含α螺旋的短肽链（A链和B链）组成,两链之间由2个二硫键链接,A链内有一条二硫键。人胰岛素和牛胰岛素具有高度的相似性。目前尚未发现内源胰岛素在体内的淀粉样沉积与疾病的关系,但作为临床应用的外源胰岛素在合成及药物储存过程中产生的淀粉样沉积可能具有免疫原性,长期使用可以严重影响其治疗效能。因此,胰岛素淀粉样纤维化的机制和筛选抑制剂已经成为当前的一个研究热点。目前已有的研究主要包括,对胰岛素分子中易于形成纤维的序列的鉴定,纤维的成核和组装过程,溶液环境如温度、pH、离子强度、表面作用力的作用,以及一些小分子和复合物对胰岛素淀粉样纤维化的影响等等。蛋白质或者多肽转变为淀粉样纤维主要取决于所处的环境条件。本文采用ThT荧光、ANS荧光、圆二色谱、拉曼光谱、透射电镜、偏振光显微镜和相关性分析等方法研究了溶液中金属离子对牛胰岛素淀粉样纤维形成的影响,结果表明,除Fe3+离子以外,所有金属离子对胰岛素淀粉样纤维化均有促进作用。这种作用与促进蛋白质疏水区暴露的作用是一致的。对金属离子的一些溶液性质与蛋白质淀粉样纤维化的延迟时间进行了相关性分析,金属离子对胰岛素纤维化的不同作用与其水合自由能、水合半径和静电常数有关。金属离子在促进胰岛素形成淀粉样纤维的过程中,胰岛素的二硫键可发生断裂,导致自由巯基生成。根据这些实验结果,进一步推测了金属离子与蛋白质的作用机理,以及蛋白质淀粉样纤维化的分子机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 淀粉样肽及其相关疾病简介
• 1.1.1 淀粉样纤维的发现和形成机制
• 1.1.2 淀粉样肽相关疾病
• 1.2 蛋白质折叠、相关的作用力和稳定性
• 1.3 蛋白质的去折叠/变性
• 1.4 蛋白质的不稳定性
• 1.4.1 蛋白质聚集-物理不稳定性
• 1.4.1.1 蛋白质聚集的机制
• 1.4.1.2 蛋白质聚集的可逆性
• 1.4.2 蛋白质的化学不稳定性
• 1.5 影响蛋白质稳定性的因素
• 1.5.1 温度
• 1.5.2 溶液pH值
• 1.5.3 吸附
• 1.5.4 盐
• 1.5.5 金属离子
• 1.5.6 螯合物
• 1.5.7 剪切力
• 1.6 胰岛素简介
• 1.6.1 胰岛素的发现
• 1.6.2 胰岛素的来源
• 1.6.3 胰岛素的性质、序列及其结构
• 1.6.4 胰岛素的作用
• 1.6.5 胰岛素与淀粉样纤维沉积
• 1.6.5.1 胰岛素淀粉样纤维沉积的研究进展
• 1.6.5.2 胰岛素淀粉样纤维沉积的研究意义
• 1.6.6 金属离子在蛋白质淀粉样纤维形成中的影响
• 1.6.6.1 研究金属离子对蛋白质淀粉样纤维形成的影响的意义
• 1.6.6.2 金属离子对蛋白质纤维化过程的影响研究进展
• 1.7 体外淀粉样纤维形成的研究内容和常用的研究方法
• 2 实验材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 Tris—HCl溶液
• 2.1.2 ThT荧光溶液
• 2.1.3 20 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.0）
• 2.1.4 ANS荧光溶液
• 2.1.5 双氧铀溶液
• 2.1.6 刚果红溶液
• 2.1.6.1 刚果红缓冲液
• 2.1.6.2 刚果红溶液
• 2.1.7 0.1M金属离子溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品制备
• 2.2.2 ThT荧光检测
• 2.2.3 ANS荧光检测
• 2.2.4 圆二色谱分析
• 2.2.5 透射电子显微镜检测
• 2.2.6 偏振光显微镜检测
• 2.2.7 相关性分析
• 2.2.8 拉曼光谱检测
• 3 结果
• 3.1 金属离子对牛胰岛素淀粉样纤维形成的影响
• 3.1.1 ThT荧光检测结果
• 3.1.2 ThT荧光检测与ANS荧光检测结果对比
• 3.2 金属离子对胰岛素的二级结构的影响
• 3.3 金属离子对牛胰岛素淀粉样纤维形貌的影响
• 3.3.1 偏振光电子显微镜下的淀粉样纤维形态
• 3.3.2 透射电子显微镜下的淀粉样纤维形态
• 3.4 拉曼光谱检测
• 3.5 金属离子的物理常数与胰岛素形成淀粉样纤维的延迟时间的相关性分析
• 3+和Fe²⁺对胰岛素形成淀粉样纤维的影响'>3.6 Fe³⁺和Fe²⁺对胰岛素形成淀粉样纤维的影响
• 3.6.1 ThT荧光检测
• 3.6.2 透射电镜
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果