海洋放线菌Y12-26活性次级代谢产物的分离纯化、结构鉴定及其菌种鉴定

论文摘要

从国家海洋局第一海洋研究所得到一批海洋微生物,对其进行农用活性筛选,得到一株其代谢产物对植物病原真菌具有抑制活性的海洋放线菌Y12-26。本文对海洋放线菌Y12-26的抑菌活性组分进行了分离纯化及结构鉴定,并对产生菌进行了菌种分类鉴定。以对稻瘟病菌的生物活性为跟踪,通过溶剂萃取和浸取、硅胶柱层析、薄层层析、高效液相色谱制备等方法,对海洋放线菌Y12-26的发酵代谢产物中的活性组分进行了分离纯化,得到了三个抑菌活性化合物,暂时命名为Y12-26-A2a、Y12-26-A3a和Y12-26-A3b,通过UV、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D NMR对其进行结构鉴定,经结构解析,确定化合物Y12-26-A2a分子量为604,分子式为C35H56O8,结构中含有十六元环内酯,与已知化合物bafilomycin D结构相同；化合物Y12-26-A3a分子量为622,分子式为C35H58O9,其结构与vacuolar氢离子通道ATP酶抑制剂bafilomycinA1相同；化合物Y12-26-A3b分子量为606,分子式为C35H58O8,确定其为新结构化合物,含有十六元环内酯和六元环醚结构,是一种只有一个甲氧基的bafilomycins结构类似物,并命名为bafilomycin K。对此三个化合物建立了可用于检测发酵和分离提取过程中其含量的HPLC分析检测方法。经生物活性测定,发现Y12-26-A3a和A3b对Pyricularia oryzae的MIC分别为16和31μg／ml,Y12-26-A2a和A3b在250μg／ml时对Pyricularia oryzae具有微弱的抑菌活性。通过对海洋放线菌Y12-26的16S rDNA基因序列分析、形态学观察、培养特征以及生理生化特征,确定其为Streptomyces flavotricini中的一员。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 农用抗生素的研究进展
• 1.1.1 农用抗生素的起源及分类
• 1.1.2 国内外农用抗生素的研究概况
• 1.1.3 农用抗生素的研究展望
• 1.2 海洋微生物活性代谢产物的研究进展
• 1.2.1 海洋细菌产生的活性代谢产物
• 1.2.2 海洋真菌产生的活性代谢产物
• 1.2.3 海洋放线菌产生的活性代谢产物
• 1.2.4 海洋微藻产生的活性代谢产物
• 1.2.5 国内研究进展
• 1.3 本课题的立题背景及研究意义
• 第2章 海洋放线菌Y12-26的初步发酵优化及活性组分的早期鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验菌种
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 海洋放线菌Y12-26的抗菌活性测定
• 2.2.2 海洋放线菌Y12-26的发酵培养
• 2.2.3 海洋放线菌Y12-26活性产物在发酵液中的分布研究
• 2.2.4 海洋放线菌Y12-26的初步发酵优化
• 2.2.5 海洋放线菌Y12-26活性产物的酸碱稳定性研究
• 2.2.6 海洋放线菌Y12-26活性产物的热稳定性研究
• 2.2.7 海洋放线菌Y12-26活性产物的极性研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 海洋放线菌Y12-26活性产物在发酵液中的分布
• 2.3.2 海洋放线菌Y12-26活性产物的初步发酵优化
• 2.3.3 海洋放线菌Y12-26活性产物的酸碱稳定性
• 2.3.4 海洋放线菌Y12-26活性产物的热稳定性
• 2.3.5 海洋放线菌Y12-26活性产物的极性
• 2.4 本章小结
• 第3章 海洋放线菌Y12-26抑菌活性组分的分离纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验试剂与材料
• 3.2 海洋放线菌Y12-26活性组分粗品的制备
• 3.2.1 海洋放线菌Y12-26的发酵培养
• 3.2.2 海洋放线菌Y12-26的发酵液预处理
• 3.2.3 海洋放线菌Y12-26活性产物的萃取
• 3.3 TLC条件探索
• 3.3.1 实验方法
• 3.3.2 结果与分析
• 3.4 硅胶柱层析
• 3.4.1 实验方法
• 3.4.2 结果与分析
• 3.5 TLC制备样品
• 3.5.1 实验方法
• 3.5.2 结果与分析
• 3.6 HPLC条件探索
• 3.6.1 实验方法
• 3.6.2 结果与分析
• 3.7 HPLC制备样品
• 3.7.1 组分Y12-26-A2a和A2b的制备及纯度分析
• 3.7.2 组分Y12-26-A3a和A3b的制备及纯度分析
• 3.7.3 组分Y12-26-A4a和A4b的制备及纯度分析
• 3.8 海洋放线菌Y12-26活性组分纯样品的制备工艺
• 第4章 海洋放线菌Y12-26活性代谢产物的结构鉴定
• 4.1 实验仪器
• 4.2 化合物Y12-26-A2a的结构鉴定
• 4.3 化合物Y12-26-A3a的结构鉴定
• 4.4 化合物Y12-26-A3b的结构鉴定
• 4.5 结果与讨论
• 第5章 海洋放线菌Y12-26活性代谢产物分析方法的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器与溶剂
• 5.1.2 标准曲线的绘制
• 5.1.3 样品预处理
• 5.1.4 发酵效价的计算及分析方法的评价
• 5.2 组分Y12-26-A2a分析方法的研究
• 5.2.1 组分Y12-26-A2a标准曲线的绘制
• 5.2.2 组分Y12-26-A2a发酵效价的计算
• 5.2.3 分析方法的精密度
• 5.2.4 分析方法的准确性-回收率的测定
• 5.3 组分Y12-26-A3a分析方法的研究
• 5.3.1 组分Y12-26-A3a标准曲线的绘制
• 5.3.2 组分Y12-26-A3a发酵效价的计算
• 5.3.3 分析方法的精密度
• 5.3.4 分析方法的准确性-回收率的测定
• 5.4 组分Y12-26-A3b分析方法的研究
• 5.4.1 组分Y12-26-A3b标准曲线的绘制
• 5.4.2 组分Y12-26-A3b发酵效价的计算
• 5.4.3 分析方法的精密度
• 5.4.4 分析方法的准确性-回收率的测定
• 5.5 结果与讨论
• 第6章 海洋放线菌Y12-26活性代谢产物的生物活性测试
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 活性化合物离体活性测试方法
• 6.1.3 代谢产物活体活性测试方法
• 6.2 海洋放线菌Y12-26代谢产物的离体活性
• 6.3 海洋放线菌Y12-26代谢产物的活体活性
• 6.4 结果与讨论
• 第7章 海洋放线菌Y12-26的菌种鉴定
• 7.1 材料与仪器
• 7.1.1 菌株
• 7.1.2 药品与试剂
• 7.1.3 主要实验仪器
• 7.1.4 培养基
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 菌落培养特征及菌株个体形态特征
• 7.2.2 菌株生理生化特征实验
• 7.2.3 16S rDNA的抽提、测序及分析
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 菌株Y12-26的培养特征
• 7.3.2 菌株Y12-26的菌落及个体形态特征
• 7.3.3 菌株Y12-26的生理生化特征
• 7.3.4 菌株Y12-26的16S rDNA测序结果
• 7.3.5 菌株Y12-26系统进化树的构建与分析
• 7.4 本章结论
• 第8章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录