藜蒿有效成分分离分析方法及其药用机理研究

论文摘要

藜蒿作为一种开发前景较好的野生植物资源,具有止血消炎、镇咳化痰、开胃健脾、散寒除湿等多种功效,药用价值极高。本文以藜蒿为研究对象,以现代新兴样品前处理技术为手段,从藜蒿中选择性提取以芦丁为代表的黄酮类活性成分,系统研究了各因素对提取率的影响,确定了活性成分最优提取及纯化条件;同时建立了藜蒿药材指纹图谱质量控制标准,进行了分子印迹固相萃取法（MISPE）选择性分离提取藜蒿等中药中的活性成分芦丁的研究,并对藜蒿黄酮类代表物质芦丁的衍生物与蛋白质的相互作用机理进行了研究,以期为新药开发提供理论依据。具体内容如下:1、超声辅助提取藜蒿中活性成分芦丁建立了一种超声辅助萃取-高效液相色谱方法提取并定量检测藜蒿中的活性成分芦丁。通过单因素实验及正交实验对其提取工艺进行了优化,得到最佳提取条件为:采用体积比为90:10的甲醇-乙醇体系,在固液比为1:30 g/mL的条件下超声提取40 min。为了体现超声辅助提取的优越性,将该方法与其他几种提取方法进行了比较,其中包括微波辅助提取、冷凝回流提取及室温冷浸提取法。用高效液相色谱法测定芦丁含量,分析准确、快速,线性范围在0.34～20.7μg/mL之间。样品的平均回收率为100.77%,RSD为0.37%（n=5）。最后对不同产地的藜蒿生药材中芦丁的含量进行了检测。因产地不同,藜蒿中芦丁的含量存在显著差异,芦丁的总含量分别为9.90, 6.23, 5.56 mg/g。2、分子印迹固相萃取法（MISPE）选择性提取复杂中药中活性成分芦丁将改进的分子印迹制备方法运用于芦丁分子印迹聚合物的制备工艺。该方法建立在超声洗脱模板分子的基础上,采用本体聚合法进行聚合物制备,以芦丁为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸脂为交联剂,在四氢呋喃的极性环境中热引发聚合。同时比较了几种不同模板分子洗脱方法,并运用红外及电镜扫描对聚合物微观结构进行表征。接着运用高效液相色谱技术评价了该聚合物的识别机制及吸附能力。将其作为固相萃取柱的吸附剂,研究了分子印迹聚合物对芦丁的选择性吸附性能,同时考察了其对实际样品中活性成分芦丁的分离富集能力。结果表明:该固相萃取柱对芦丁两种结构类似物的选择性系数分别为2.80和5.46。该分子印迹固相萃取柱对芦丁具有较佳的回收率（85%～91%）和高度选择性,为从中药中高效分离富集芦丁提供了一种新途径。3、藜蒿二维指纹图谱的创建建立了包含色谱及光谱信息的藜蒿二维指纹图谱。与固定检测波长的一维指纹图谱相比,二维指纹图谱信息数据量更大,包含更多样品信息,能更全面的控制藜蒿的质量。同时利用二维数据所含信息,对样本进行相似度评价、聚类分析及主成分分析评价。相似度评价结果将不同来源的藜蒿样品分为两组:0.9883-0.9839及0.8853-0.8907,其样品的来源分别对应于南方及北方,表明地理位置相近的藜蒿样品性质相似,进而的聚类分析及主成分分析也得到了相似的结果。该方法具有良好的系统性、特征性和重现性,为藜蒿的质量控制提供了依据。4、蛋白质与藜蒿活性成分芦丁衍生物相互作用机理研究首先用芦丁和环氧乙烷反应得到芦丁衍生物—曲克芦丁（troxerutin,TRO）,接着应用光谱技术研究曲克芦丁与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）间的作用机制。结果表明:曲克芦丁对HSA的荧光猝灭机制为静态猝灭;TRO与HSA作用时结合比为2;反应的热力学参数ΔH>0,ΔS>0。结论:曲克芦丁与HSA之间的主要作用是疏水作用力;曲克芦丁的加入使HSA构象发生了变化。本工作从分子水平认识该反应的作用机制,在医学、药理学和生物学等方面均有十分重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 我国藜蒿资源及其研究现状
• 1.1.1 我国藜蒿资源概况
• 1.1.2 藜蒿药用价值
• 1.1.3 藜蒿化学成分
• 1.1.4 藜蒿研究进展
• 1.1.5 问题与展望
• 1.2 中药样品前处理技术
• 1.2.1 中药有效成分传统提取方法
• 1.2.2 中药有效成分新提取方法
• 1.2.3 问题与展望
• 1.3 分子印迹技术在复杂样品前处理中的应用
• 1.3.1 分子印迹技术
• 1.3.2 固相萃取技术
• 1.3.3 分子印迹技术在固相萃取中的应用
• 1.3.4 问题与展望
• 1.4 指纹图谱技术
• 1.4.1 指纹图谱的原理
• 1.4.2 指纹图谱在中药研究中的应用
• 1.4.3 问题与展望
• 1.5 药物小分子与人血清白蛋白相互作用
• 1.5.1 人血清白蛋白的结构及功能
• 1.5.2 分析测试方法
• 1.5.3 问题与展望
• 1.6 本课题研究背景、意义及内容
• 1.6.1 本课题背景及研究意义
• 1.6.2 本论文研究内容
• 第2章 藜蒿中活性成分芦丁的提制分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 液相色谱条件的优化
• 2.3.2 定性分析结果
• 2.3.3 标准曲线的绘制
• 2.3.4 提取溶剂的选择
• 2.3.5 不同提取方法的比较
• 2.3.6 超声提取条件的优化
• 2.3.7 方法学考察结果
• 2.3.8 回收率实验
• 2.3.9 样品分析结果
• 2.4 小结
• 第3章 分子印迹固相萃取法选择性提取中药中活性成分芦丁
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 模板分子洗脱条件的优化
• 3.3.2 芦丁分子印迹聚合物的表征
• 3.3.3 聚合物的静态吸附性能实验
• 3.3.4 吸附等温线
• 3.3.5 分子印迹固相萃取性能研究
• 3.3.6 分子印迹固相萃取技术在中药样品中的应用
• 3.3.7 回收率实验
• 3.3.8 方法学考察
• 3.4 小结
• 第4章 藜蒿二维指纹图谱的建立
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验药材
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 二维指纹图谱的创建
• 4.2.5 数据分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 样品提取工艺的优化
• 4.3.2 藜蒿指纹图谱的创建
• 4.3.3 二维指纹图谱与一维指纹图谱的比较
• 4.3.4 数据分析
• 4.3.5 方法学研究
• 4.4 小结
• 第5章 曲克芦丁与人血清白蛋白相互作用光谱学研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器和试剂
• 5.2.2 曲克芦丁的合成方法
• 5.2.3 精制
• 5.2.4 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 曲克芦丁的化学结构确证
• 5.3.2 曲克芦丁的含量标定
• 5.3.3 光谱学研究
• 5.4 小结
• 结论与展望
• 1 结论
• 2 本论文创新之处
• 3 展望
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢