论文摘要
第一部分缺氧-复氧肾小管上皮细胞损伤的信号传导机制目的:将人肾脏近曲小管上皮细胞株（Human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2）为研究对象,体外人工模拟缺氧-复氧环境,探讨缺氧-复氧（Hypoxia/Re-oxygenation, H/R）肾小管上皮细胞损伤的信号传导机制。方法:将HK-2细胞根据不同处理分为3组:对照组、缺氧-复氧组（H/R组）和PDTC干预组。对照组HK-2细胞用DMEM常氧培养;H/R组HK-2细胞在缺氧下培养24小时后在常氧（复氧）下继续培养24小时;PDTC干预组HK-2细胞加入PDTC后在缺氧下培养24小时再常氧（复氧）培养24小时。于缺氧6、12、24小时和缺氧24小时后复氧6、12、24小时分别获取各组标本,应用MTT法细胞计数检测HK-2细胞存活数,免疫组化法检测NF-κB p65蛋白表达,逆转录-多聚酶链反应（Reverse transcription- polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测细胞间粘附因子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1） mRNA转录,酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测ICAM-1蛋白表达情况。结果:H/R组HK-2细胞数量在缺氧6小时明显减少,24小时达最低值（呈时间依赖性）,复氧后稍有升高,与对照组各对应时间点相比均有统计学差异（P<0.05）。与对照组相比,H/R组HK-2细胞NF-κB p65阳性蛋白表达（平均光密度值）,ICAM-1mRNA表达（光密度比值）和ICAM-1蛋白浓度（pg/ml）表达在各对应时间点均明显增高,有统计学差异（P<0.05）。PDTC组HK-2细胞数量多,NF-κB p65阳性蛋白表达,ICAM-1mRNA转录和ICAM-1蛋白表达均降低,各对应时间点的各项检测指标分别与H/R组和对照组相比均有统计学差异（P<0.05）。Pearson相关系数r=0.821,P<0.05,故可认为ICAM-1蛋白浓度与NF-κB p65阳性表达之间存在正相关关系。结论:1.本研究将HK-2细胞株置于无血清无糖DMEM中充以95%N2/5%CO2混合气体进行细胞培养,模拟体内组织缺氧缺血再灌注环境,成功地复制了体外缺氧-复氧性HK-2细胞损伤模型。此方法操作简单、易行、结果稳定。2.H/R条件下HK-2细胞培养呈时间依赖性地激活NF-κB,促进ICAM-1mRNA转录及ICAM-1mRNA蛋白的表达。PDTC干预能明显降低H/R近端肾小管上皮细胞ICAM-1mRNA转录和ICAM-1蛋白表达。3.H/R导致HK-2细胞损伤的胞内信号传导机制可能是H/R首先刺激NF-κB活化使得HK-2细胞表面ICAM-1表达增加进而促进多形核中性白细胞（Polymorphonuclear neutrophils, PMNs）的粘附。第二部分白藜芦醇苷对缺氧-复氧肾小管上皮细胞损伤保护作用的研究目的:探讨白藜芦醇苷（Polydatin,PD）对体外缺氧-复氧HK-2细胞损伤的保护作用。方法:本实验HK-2细胞根据不同处理分为4组:对照组、H/R组、PDTC干预组和PD处理组。对照组HK-2细胞用DMEM常氧培养; H/R组HK-2细胞在缺氧下培养24小时后在常氧（复氧）下继续培养24小时; PDTC干预组和PD处理组HK-2细胞均加入PDTC后在缺氧下培养24小时再在常氧（复氧）下培养24小时。于缺氧24小时后复氧6小时分别获取各组标本,应用MTT法细胞计数检测HK-2细胞存活数,免疫组化法检测NF-κB p65蛋白表达,RT-PCR法检测ICAM-1mRNA转录,ELISA法检测ICAM-1蛋白表达情况。结果:PD处理组各对应时间点HK-2细胞数量明显增多于H/R组,有明显统计学差异（P<0.05）。PD处理组NF-κB p65蛋白阳性表达,ICAM-1mRNA转录及ICAM-1蛋白表达在各对应时间点均明显低于对照组,有统计学差异（P<0.05）。PD处理组与PDTC组各对应时间点的各项检测指标比较均无显著统计学差异（P>0.05）。结论:本研究结果表明PD对H/R诱导的HK-2细胞损伤具有一定的保护作用。其保护机制可能是通过抑制NF-κB的活化,下调ICAM-1mRNA转录及蛋白表达,减少了PMNs的粘附。
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