论文摘要
目的:角膜碱烧伤是临床常见而严重的化学性眼外伤。常因角膜融解、溃疡、穿孔和新生血管形成等严重的病理改变而导致视力丧失。特别是角膜新生血管的形成大大降低了碱烧伤后角膜移植手术的成功率。因此,角膜碱烧伤后新生血管的防治一直是国内外学者研究的热点。近年来,几丁糖因其独特的生物学特性,引起了国内外学者的广泛关注。其作为一种氨基多糖的高分子聚合物,已被证实具有良好的抗炎、抗微生物、促进组织修复、抑制纤维增生及抗氧化损伤等多种生物活性。但在国内应用几丁糖抑制眼部新生血管的研究报导较为少见。本试验将医用几丁糖用于兔角膜碱烧伤模型,观察其抑制碱烧伤后新生血管的功效,并通过对多形核粒细胞（PMN）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的半定量检测,探讨其作用机制,从而为医用几丁糖防治角膜碱烧伤新生血管形成的临床应用提供理论和实验依据。方法:选用健康新西兰大白兔48只,氢氧化钠（NaOH）烧伤右眼角膜制备角膜新生血管模型。随机将48只兔分为2组:碱烧伤组（碱烧伤）和几丁糖组（碱烧伤+2%医用几丁糖点眼4/日）每组24只。每日在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管生长情况,并用数码相机照相记录。碱烧伤后1、4、7、14天,各组分别随机选取6只兔空气栓塞处死,摘除右眼球,取角膜,其中1/2固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋制成组织切片,HE染色,光镜下观察,发现细胞核多个者为多形核白细胞（PMN）,在物镜放大率为40倍时,逐个视野计数。光镜下观察经免疫组化染色（Sp法）后血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在角膜的表达情况,并用计算机-图象分析仪对其进行面密度分析（注:面密度值越高,阳性目标越大,相应的阳性细胞数越多）。其余部分角膜组织切成1mm3大小,固定于戊二醛缓冲溶液中制作成透射电镜标本,观察碱烧伤后角膜上皮组织的超微结构。实验数据用SPSS12.0统计软件分析。结果:1裂隙灯显微镜观察:碱烧伤组术后第1天,分泌物明显增多,角膜缘血管网充盈,角膜上皮脱落。第3天,角膜缘有新生血管长入,生长较快,角膜上皮修复。第7天,新生血管侵犯角膜中央。第14天,新生血管较密集,但开始消退,角膜白斑明显。几丁糖组术后第1天,分泌物较少,角膜缘血管网充盈不明显,角膜上皮点状脱落。第3天,角膜缘开始有新生血管长入,生长较慢,角膜上皮修复。第7天新生血管较短,未侵入角膜中央。第14天,新生血管较稀疏,未见明显的角膜白斑形成。2角膜新生血管面积统计:伤后第1天,碱烧伤组和几丁糖组均无新生血管生长。伤后第4、7、14天,碱烧伤组角膜新生血管的面积（mm2）分别为21.30±6.24、38.86±6.38、40.37±5.71 ,几丁糖组角膜新生血管的面积分别为13.06±4.45、27.69±4.87、30.81±3.07。伤后第4天,几丁糖组较碱烧伤组角膜新生血管面积减小（P<0.05）;伤后第7天和第14天,几丁糖组较碱烧伤组角膜新生血管面积明显减小（P<0.01）。3 PMN计数:伤后第1、4、7、14天,碱烧伤组角膜PMN计数分别为:14.23±1.72、19.20±2.40、28.70±1.63、15.10±2.09,几丁糖组角膜PMN计数分别为11.23±1.33、15.30±2.24、20.00±1.60、12.22±1.09。各时期,几丁糖组角膜PMN计数均较碱烧伤组均明显降低（P<0.01）。4角膜组织VEGF, MMP-2的免疫组织化学染色:VEGF、MMP-2在角膜中的免疫定位主要位于角膜上皮细胞、基质纤维细胞、浸润的炎症细胞和新生的血管内皮细胞胞浆内。4.1角膜VEGF的表达:伤后第1、4、7、14天,碱烧伤组角膜VEGF面密度值分别为0.0844±0.0348、0.1029±0.0379、0.7256±0.0100、0.0316±0.0074,几丁糖组角膜VEGF面密度值分别为0.0346±0.0080、0.0699±0.0150、0.5334±0.1602、0.0388±0.0445。伤后第1天,几丁糖组VEGF面密度值较碱烧伤组明显降低（P<0.01）。伤后第4、7天,几丁糖组VEGF面密度值较碱烧伤组降低（P<0.05）。伤后第的14天,两组VEGF面密度值之间无显著性差异。4.2角膜MMP-2的表达:伤后第1、4、7、14天,碱烧伤组角膜MMP-2面密度值分别为0.0537±0.0090、0.0616±0.0126、0.1315±0.0605、0.0713±0.0112,几丁糖组角膜MMP-2面密度值分别0.0275±0.0112、0.0365±0.0083、0.0698±0.0107、0.0616±0.0121。伤后第1、4天,几丁糖组MMP-2面密度值较碱烧伤组明显降低（P<0.01）。伤后第7、14天,几丁糖组MMP-2面密度值较碱烧伤组降低（P<0.05）。5组织病理学改变5.1光镜:碱烧伤组角膜上皮损伤严重,生长缓慢,细胞形状不规则且排列不整齐,炎症细胞浸润严重,新生血管出现较早且生长迅速,壁厚,管腔较粗,可见管腔内有红细胞充盈,基质胶原纤维断裂溶解较多,且恢复较慢。几丁糖组角膜上皮损伤较轻微且恢复较快,炎症细胞浸润较碱烧伤组轻,新生血管出现较晚且生长缓慢,壁薄,管腔较细,闭塞。基质胶原纤维排列不整齐但恢复较快。5.2电镜:碱烧伤组上皮细胞游离面微绒毛脱落,数量明显减少,细胞间半桥粒连接数量减少。核周隙增大,细胞质内有多数空泡、水肿。基底细胞胞质内粗面内质网中度扩张,有不同程度的脱颗粒现象。线粒体局部水肿,嵴数量减少,排列紊乱,部分或大部分嵴融合消失。几丁糖治疗组微绒毛数量减少不明显,排列整齐,半桥粒连接基本正常。核周隙稍增大,细胞质内空泡数量较少,未见明显水肿。基底细胞胞质内粗面内质网扩张,有轻度脱颗粒现象。线粒体水肿较轻,可见嵴部分消失。结论:1 PMN、VEGF、MMP-2通过不同的途径参与了碱烧伤后角膜新生血管的形成过程。2医用几丁糖通过抑制炎症反应,降低碱烧伤后角膜上皮细胞、基质纤维细胞中VEGF和MMP-2的含量,从而抑制角膜新生血管的生成。3医用几丁糖具有保护角膜上皮细胞,减少损伤,促进角膜上皮修复的作用。
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