中DO条件SBR畜禽废水系统中亚硝化细菌群落多样性研究

论文摘要

本研究在初设了各种不同DO条件的SBR水处理系统中,发现当DO为3.0 mg/L,（中溶解氧）时,系统的脱氮效果最好并实现了SHARON（短程硝化反硝化）工艺。因此,以该条件下的好氧活性污泥为研究对象,克服其含激素,病原菌,兽药,重金属等多种抑制物的特点,提取污泥总DNA,利用分子生物学方法,通过对亚硝化细菌目的基因片断PCR扩增,产物克隆等方法,旨在了解该畜禽废水处理系统中亚硝化细菌的群落多样性,从而将脱氮过程中亚硝态氮的积累与作用亚硝化菌组成结合起来,为废水处理系统中菌种的鉴定和结构的了解提供了一定依据。实验结果表明:（1）在保持F/M、C/N、pH、MLSS以及温度恒定的情况下,SBR系统短程工艺中,DO浓度与“三氮”浓度的变化有良好的相关性,DO越低,氨氮的去除率越低,亚硝态氮和硝态氮基本没有出现积累。当DO为3.0mg/L时,亚硝基氮积累率达到94.9%,远大于硝态氮的积累,实现了短程硝化反硝化过程,出水中氨氮几乎为0。（2）除低溶解氧（0.5mg/L,1.0mg/L）条件以外,COD的去除率基本保持在95%左右,说明有机物的去除在一定程度上与溶解氧呈正相关,在短程硝化反硝化工艺中采用曝气量（≥3.0mg/L）可以缩短COD降解的时间。（3）通过“蛋白酶K+CTAB+SDS”法提取污泥总DNA,并结合冻融处理和玻璃珠研磨震荡法进行比较,结果表明:采取摇床加反复冻融效果最好,DNA纯度最高(OD260/OD280大于1.80),并且通过PCR扩增,得到了目的基因,说明该DNA提取方法可以不经纯化和任何特殊处理而直接进行分子生物学下游操作,是一种简便,高效的提取方法。（4）利用正交设计,从模板浓度,Mg2+浓度,dNTP浓度以及引物浓度4个因素对PCR反应体系进行优化分析,并确定最适退火温度。结果表明:在PCR反应25μL体系中最佳反应组合为:模板DNA 0.32μg,dNTP200μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq DNA聚合酶0.2U,最适退火温度则为52℃。（5）通过PCR产物回收纯化,TA克隆,在进行了RFLP分型以后,将克隆子进行测序,通过序列同源性比较表明:在DO=3.0mg/L条件下SBR畜禽废水处理系统中,主要存在欧洲亚硝化单胞菌、亚硝化螺菌和亚硝化球菌三大类亚硝化细菌,其中起主要作用的是多型亚硝化螺菌（Nitrosospira multiformis）和欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomomas europaea）。（6）考察低DO（0.5 mg/L）条件下的亚硝化细菌组成,将随机挑选的阳性克隆子测序后发现,该条件下亚硝化细菌仅有亚硝化单胞菌一种。同时在本试验SHARON工艺中得出DO=3.0 mg/L时亚硝态氮的积累量为DO=0.5 mg/L时的16.4倍,这说明在废水处理系统中,亚硝化细菌群落的多样性是保证高脱氮率的重要原因。（7）在中温（30℃～32℃）畜禽废水SBR好氧污泥中,多种亚硝化细菌共同发挥了作用,其中的亚硝化螺菌属,不仅与标准菌株同源性高达97.4%,而且其频度也最高,是该水处理系统中的优势菌种,同时除亚硝化螺菌外,亚硝化单胞菌,亚硝化球菌和一些未被培养的细菌也为脱氮作了贡献。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 样品总DNA在环境微生物基因组学中的应用研究现状
• 1.1.1 土壤环境
• 1.1.2 消化道环境
• 1.1.3 极端环境
• 1.1.4 污染环境
• 1.1.5 其他环境
• 1.2 总DNA在功能微生物基因组学中的应用研究现状
• 1.3 总DNA在比较微生物基因组学中的应用研究现状
• 1.4 微生态学常用的分子生物学技术研究现状
• 1.4.1 酶链反应（PCR）技术
• 1.4.2 寡核苷酸探针技术
• 1.4.3 DNA生物传感器
• 1.4.4 DNA重组技术
• 1.4.5 限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 1.5 亚硝化细菌分子生物学研究现状
• 1.6 硝化作用的机制、相关酶类及其基因的研究现状
• 1.7 SBR短程脱氮工艺特点
• 1.8 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 污泥驯化与水质测定
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 中DO条件下亚硝化细菌多样性研究
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同DO条件下熟龄污泥驯化状态
• 3.2 不同DO条件下氨氮的去除效果
• 3.3 不同DO条件下亚硝态氮和硝态氮的变化
• 3.4 不同DO条件下COD的去除效果
• 3.5 污泥总DNA质量检测
• 3.6 目的基因amoA片段扩增
• 3.7 PCR反应体系的正交优化
• 3.7.1 极差分析
• 3.7.2 退火温度对处理的影响
• 3.8 amoA基因片断的获得
• 3.9 PCR产物的克隆及鉴定
• 3.10 RFLP限制性内切酶分析
• 3.10.1 聚类分析
• 3.10.2 克隆子测序结果
• 4 结论
• 4.1 SBR工艺脱氮效果
• 4.2 污泥总DNA提取方法研究
• 4.3 PCR扩增体系的正交设计
• 4.4 PCR产物的克隆及测序
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文