淫羊藿多糖脂质体的制备及免疫增强作用的研究

论文摘要

脂质体是一种人工合成的具有双层膜的磷脂质小囊和赋形剂。脂质体可以作为以提高抗原的输送和递呈为主要作用的免疫佐剂。其主要优势是脂质体膜对细胞膜具有良好的亲和性,极易将包被在脂质体上或内部的药物或抗原成分输入到细胞内。另外,脂质体还能延长药物的作用时间,降低药物的毒性和减少药物的副作用等。研究发现,许多中药或中药有效成分不溶于水,或者在体内代谢快、不能持续发挥药效作用,若用脂质体对其包封,不仅能够解决这些问题,同时还能发挥两者的优势。本研究利用脂质体的包封技术,采用薄膜分散超声法,将淫羊藿多糖（epimedium polysaccharide,EPS）制备成一种新型的免疫佐剂即淫羊藿多糖脂质体（epimedium polysaccharide liposome, EPSL）,通过正交试验设计原理,筛选出制备EPSL的最佳处方；通过体内和体外试验,研究了EPSL对鸡淋巴细胞增殖、抗体效价及细胞因子分泌及mRNA表达等方面的影响,旨在研制高效、低毒的免疫增强剂。试验分为以下五个部分：.试验Ⅰ淫羊藿多糖脂质体制备条件的优选为了优选EPSL制备的最佳条件,采用薄膜分散超声法制备EPSL,以包封率和载药量为指标,以脂药比、膜材比、超声时间和载药温度为因素水平,用L9（34）正交试验对制备条件进行优选,并用鱼精蛋白法测定EPSL的包封率。结果显示,制备EPSL的最佳条件为脂药比30：1,膜材比4：1,超声时间10min,载药温度40℃。表明采用最佳条件制备的EPSL,包封率和载药量均较高。试验Ⅱ淫羊藿多糖脂质体体外对鸡淋巴细胞增殖的影响将EPSL和EPS分别用RPMI1640培养液稀释11个浓度,加入到体外培养的鸡外周血淋巴细胞中,在培养48h后用MTT法判定各试验药物的安全浓度和对细胞增殖的影响；另将自安全浓度以下5种浓度的EPSL和EPS分别加入到体外培养的鸡外周血淋巴细胞中,培养48h后,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明,各试验药物的安全浓度较低；其中EPSL和EPS均能促进淋巴细胞增殖,EPSL在62.5-3.906μg·mL-1时无论是单独作用还是协同PHA作用均能显著促进鸡外周血淋巴细胞的增殖,并且在31.25μg·mL-1和3.906μg·mL-1时,效果都显著优于EPS。试验Ⅲ淫羊藿多糖脂质体体外对鸡细胞因子mRNA表达的影响为了研究EPSL增强免疫的作用机理,测定了EPSL对鸡细胞因子（IL-2、IL-4和IFN-γ）mRNA表达的影响,以EPS作为对照。培养鸡外周血淋巴细胞,分别加入3种浓度的EPSL,培养36h后收集细胞,提取总RNA,用实时荧光定量PCR方法测定细胞因子mRNA的表达。结果表明,在62.5μg·mL-1和31.25μg·mL-1时,EPSL对3种细胞因子的诱生作用显著强于EPS,其中EPSL在62.5μg·mL-1时的作用最强,EPSL在31.25μg·mL-1时次之,并与剂量呈正相关。这可能是EPSL增强机体免疫的分子机制之一。试验Ⅳ淫羊藿多糖脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响为了比较EPSL和EPS的增强免疫作用,测定了EPSL和EPS对鸡新城疫苗免疫效果的影响。14日龄雏鸡210只,随机均分为7组,用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首免的同时,3个试验组分别肌肉注射高、中、低剂量的EPSL1个多糖对照组注射EPS,疫苗组和空白对照组注射等量生理盐水,空白对照隔离饲养。分别于首免后第7、14、21、28d心脏和翼静脉采血,用MTT法和B-微量法测定外周血T淋巴细胞增殖和血清HI抗体效价的变化。结果表明,EPSL在合适的剂量和某些时间点能显著促进T淋巴细胞增殖、提高血清抗体效价。可以得出,EPSL显著提高了EPS的药效以及佐剂活性,综合评价以EPSLH最好。试验V淫羊藿多糖脂质体对鸡血清中细胞因子水平的影响为了进一步研究EPSL增强免疫作用的机理。14日龄鸡210只,随机均分为7组,用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首免的同时,3个试验组分别肌肉注射高、中、低剂量的EPSL,1个多糖对照组注射EPS,疫苗组和空白对照组注射等量生理盐水,空白对照隔离饲养。分别于首免后第14、21和28d翼静脉采血,应用双抗体夹心法测定细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的含量变化。结果表明,EPSL在合适的剂量和某些时间点均能显著提高细胞因子的含量,综合评价以EPSLH最好。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及縮略语
• 第一章 文献综述
• 1 淫羊藿的研究概况
• 1.1 淫羊藿的生物活性成分
• 1.2 淫羊藿的药理作用
• 2 淫羊藿多糖的研究进展
• 2.1 淫羊藿多糖的化学成分
• 2.2 淫羊藿多糖的提取及纯化
• 2.3 淫羊藿多糖的药理作用
• 3 脂质体的研究进展
• 3.1 脂质体的组成
• 3.2 脂质体的分类和作用特点
• 3.3 脂质体的制备方法
• 3.4 脂质体在现代医学领域中的应用
• 3.5 脂质体的发展趋势与存在的问题
• 4 本研究的目的意义
• 参考文献
• 第二章 淫羊藿多糖脂质体制备条件的优选
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 EPSL制备
• 2 结果
• 2.1 成膜有机溶剂对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.2 载药温度对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.3 超声时间对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.4 脂药比对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.5 膜材比对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.6 水化介质对脂质体包封率和载药量的影响
• 2.7 正交试验结果分析
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第三章 淫羊藿多糖脂质体体外对鸡淋巴细胞增殖的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 外周血淋巴细胞生长和最大安全浓度测定
• 1.5 淋巴细胞增殖测定
• 1.6 数据分析
• 2 结果
• 2.1 EPSL和EPS对外周血淋巴细胞生长的影响和最大安全浓度
• 2.2 EPSL和EPS对外周血淋巴细胞增殖的影响
• 3 讨论
• 3.1 EPSL对细胞最大安全浓度的影响
• 3.2 EPSL对淋巴细胞增殖的影响
• 参考文献
• Abstract
• 第四章 淫羊藿多糖脂质体体外对鸡细胞因子mRNA表达的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 鸡外周血淋巴细胞的分离及培养
• 1.5 鸡外周血淋巴细胞总RNA的提取
• 1.6 反转录（RT）
• 1.7 PCR引物的设计
• 1.8 荧光定量PCR的测定
• 1.9 数据分析
• 2 结果
• 2.1 反应条件的优化
• 2.2 IL-2 mRNA表达量的变化
• 2.3 IL-4 mRNA表达量的变化
• 2.4 IFN-γ mRNA表达量的变化
• 3 讨论
• 3.1 EPSL对IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA表达的影响
• 3.2 测定方法
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 淫羊藿多糖脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 脂质体准备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 疫苗及检测抗原
• 1.6 动物分组及处理
• 1.7 淋巴细胞增殖测定
• 1.8 血清HI抗体效价测定
• 1.9 数据分析
• 2 结果
• 2.1 外周血T淋巴细胞增殖的动态变化
• 2.2 血清ND-HI抗体效价变化
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第六章 淫羊藿多糖脂质体对鸡血清中细胞因子水平的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物、药物和疫苗及检测抗原
• 1.2 主要仪器
• 1.3 动物分组及处理
• 1.4 样品采集
• 1.5 试验数据处理
• 2 结果
• 2.1 EPSL对鸡血清IL-2含量的影响
• 2.2 EPSL对鸡血清IL-4含量的影响
• 2.3 EPSL对鸡血清IFN-γ含量的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文结论
• 论文创新点
• 硕士期间发表的文章
• 致谢