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杂色鲍caspase细胞凋亡通路在应激和发育中的作用

2020-12-29阅读(398)

杂色鲍caspase细胞凋亡通路在应激和发育中的作用

论文摘要

细胞凋亡在发育和应激过程具有重要作用。本研究在实验室构建的杂色鲍EST数据库的基础上,并采用SMART-RACE技术共成功克隆得到5条caspases细胞凋亡通路分子基因:半胱天冬氨酸酶3（caspase-3,CASP-3）、半胱天冬氨酸酶8（caspase-8,CASP-8）、半胱天冬氨酸酶3-样蛋白（caspase 3-like protein,CASP-3lp）、转录因子激活蛋白1（transcription factor activator protein-1,AP-1）和凋亡抑制因子1（defender against apoptotic cell death 1,DAD-1）基因的cDNA,分别命名为saCASP-3、saCASP-8、saCASP-3lp、saAP-1和saDAD-1,并采用实时定量PCR（qPCR）和基因沉默等技术分析此通路基因在杂色鲍幼虫发育及成体免疫、温度、缺氧应激过程中的作用。主要的研究结果如下:1)saCASP-3 cDNA长为1192bp,编码276个氨基酸残基,其编码蛋白具有1个高度保守的P20功能结构域（35aa-155aa）和1个P10功能结构域（184aa-275aa）。预测的氨基酸序列中包含HKDTDCFVCVILTHG和QACRG两个保守基序。qPCR显示,saCASP-3mRNA在杂色鲍成体各组织中均有表达,在血淋巴中表达量最高,极显著高于其他组织（P<0.01）;自受精卵开始saCASP-3 mRNA在各发育阶段均有表达,在胚胎发育早期阶段高表达,晚期阶段表达量较低,具有显著性差异（P<0.05）;副溶血弧菌感染后,血淋巴中saCASP-3 mRNA的表达量在12h显著上调（P<0.05）;高温应激后,鳃中saCASP-3 mRNA的表达量在处理后立即显著上调（P<0.05）,血淋巴和肝胰腺中的表达量在处理后24h显著上调（P<0.05）;缺氧处理后,鳃中saCASP-3 mRNA的表达量在处理后96h显著上调（P<0.05）,血淋巴的表达量在处理后4h显著上调（P<0.05）。对担轮幼虫幼虫进行saCASP-3 RNA干扰实验结果表明,处理组的畸形率与未处理组的畸形率相比极显著增加了33.1%（P<0.01）。2)saCASP-8 cDNA长为1001bp,编码260个氨基酸残基。其编码蛋白具有1个高度保守的P20功能结构域（1aa-108aa）和1个P10功能结构域（162aa-247aa）。qPCR显示,saCASP-8 mRNA在杂色鲍成体各组织中均有表达,但肝胰腺中表达量最高,极显著高于其它组织（P<0.01）;自受精卵开始saCASP-8 mRNA在各发育阶段均有表达,表达水平随着发育进程逐渐降低,至面盘幼虫阶段表达量达到最低（P<0.05）,变态后表达水平有所上升;副溶血弧菌感染后,血淋巴中saCASP-8 mRNA的表达量在处理后3h显著上调（P<0.05）;高温应激能够显著上调血淋巴中saCASP-8 mRNA的表达量（P<0.05）;缺氧处理后,血淋巴中saCASP-8 mRNA的表达量在96h显著上调（P<0.05）。3)saCASP-3lp cDNA全长为1371bp,编码244个氨基酸,其编码蛋白包含1个CARD结构域（1aa-91aa）。qPCR显示,saCASP-3lp mRNA在杂色鲍成体各组织中均有表达,在粘液腺中表达量最高;在胚胎和幼虫发育过程中,saCASP-3lp在前面盘幼虫晚期中表达量最高,而在其他各阶段表达量较低,形成显著性差异;副溶血弧菌感染后,血淋巴中saCASP-3lp mRNA的表达量在处理后6 h显著上调（P<0.05）;高温应激后,血淋巴中saCASP-3lp mRNA的表达量在24h显著上调（P<0.05）;缺氧处理后,血淋巴中saCASP-3lp mRNA的表达量在192h显著上调（P<0.05）。对担轮幼虫幼虫进行saCASP-3lp RNA干扰实验结果表明,处理组的畸形率与未处理组的畸形率相比极显著增加了30.5%（P<0.01）。4)saAP-1 cDNA全长为1482bp,编码315个氨基酸,其编码蛋白具有1个JTF结构域（38 aa-226aa）和1个bZIP结构域（235 aa-299 aa）。qPCR结果显示,saAP-1 mRNA在杂色鲍成体各组织中均有表达,在血淋巴中表达量最高,其次是鳃,两者均显著高于其它组织（P<0.05）;在胚胎和幼虫发育过程中,saAP-1 mRNA在胚胎发育早期阶段几乎没有表达,从担轮幼虫早期开始,随着胚胎和幼虫的变态发育表达量呈极显著上调趋势（P<0.01）;副溶血弧菌感染后,血淋巴中saAP-1 mRNA的表达量在第24h迅速显著上调（P<0.05）。5)saDAD-1 cDNA全长为553bp,编码130个氨基酸,其编码蛋白具有1个DAD结构域（4aa-113aa）,有3段跨膜区域。qPCR结果显示,saDAD-1基因在杂色鲍成体各组织中均有表达,在消化道中表达量最高;在胚胎和幼虫发育过程中,saDAD-1基因在变态前开始高量表达,表明该基因可能参与杂色鲍幼虫变态过程;弧菌感染后,血淋巴中saDAD-1mRNA的表达量在12h著上调（P<0.05）;高温应激后,血淋巴的表达量在4h迅速显著上调（P<0.05）;缺氧处理后,血淋巴的表达量在96h显著上调（P<0.05）。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 引言
  • 1.1 杂色鲍的养殖现状及面临的问题
  • 1.1.1 杂色鲍的养殖
  • 1.1.2 鲍免疫和应激存在密切关系
  • 1.2 caspase细胞凋亡通路及其在水生无脊椎动物的研究进展
  • 1.2.1 caspase依赖性细胞凋亡通路类
  • 1.2.2 水生无脊椎动物中的caspase通路分子基因表达情况
  • 1.3 细胞凋亡通路相关基因的研究进展
  • 1.3.1 转录因子激活蛋白1的研究进展
  • 1.3.2 凋亡抑制因子1的研究进展
  • 1.4 本研究的目的与意义
  • 1.5 主要研究内容和技术路线
  • 1.5.1 主要研究内容
  • 1.5.2 主要技术路线
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 实验动物
  • 2.1.2 主要仪器和试剂
  • 2.1.3 引物
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 总RNA的提取（RDP法）和去除DNA的污染
  • 2.2.2 合成RT-PCR cDNA第一链和PCR扩增获取基因cDNA片段
  • 2.2.3 SMART-RACE技术获取基因全长
  • 2.2.4 割胶纯化基因片段
  • 2.2.5 与质粒载体连接
  • 2.2.6 感受态细胞的转化及筛选
  • 2.2.7 质粒插入片段的检测
  • 2.2.8 质粒测序
  • 2.2.9 目的基因的生物信息学分析
  • 2.2.10 杂色鲍应激处理
  • 2.2.11 绝对定量PCR及实时定量PCR反应体系及条件
  • 2.2.12 RNAi实验
  • 第3章 结果
  • 3.1 杂色鲍各组织总RNA的抽提结果
  • 3.2 RACE-PCR扩增结果
  • 3.3 saCASP-3、saCASP-8、saCASP-3lp、sa AP-1 和saDAD-1 基因序列分析
  • 3.3.1 saCASP-3 基因序列分析
  • 3.3.2 saCASP-8 基因序列分析
  • 3.3.3 saCASP-3lp基因序列分析
  • 3.3.4 saAP-1 基因序列分析
  • 3.3.5 saDAD-1 基因序列分析
  • 3.4 saCASP-3、saCASP-8、saCASP-3lp、saAP-1 和sa DAD-1 基因的表达特征
  • 3.4.1 saCASP-3 基因的表达特征
  • 3.4.2 saCASP-8 基因的表达特征
  • 3.4.3 saCASP-3lp基因的表达特征
  • 3.4.4 saAP-1 基因的表达特征
  • 3.4.5 saDAD-1 基因的表达特征
  • 3.5 casp-3 和casp3lp RNAi实验结果
  • 3.5.1 杂色鲍胚胎和早期幼体各主要形态阶段的发育过程
  • 3.5.2 saCASP-3 RNAi实验结果
  • 3.5.3 saCASP-3lp RNAi实验结果
  • 第4章 讨论
  • 4.1 半胱天冬氨酸酶 3
  • 4.2 半胱天冬氨酸酶 8
  • 4.3 半胱天冬氨酸酶3样蛋白
  • 4.4 转录因子激活蛋白 1
  • 4.5 抗细胞凋亡因子 1
  • 第5章 结论与展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 在学期间发表的学术论文

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