基于T7启动子的原核增强子样序列筛选及其功能区域研究

论文摘要

增强子（enhancer）是包含转录因子结合位点的顺式作用元件,对靶基因表达具有激活作用,但目前其分子作用机制并不清楚。人们发现在原核生物的基因组和某些病毒基因组的一些DNA片段中具有增强子样功能。研究表明原核增强子样序列可作为原核表达系统改进的一种工具。T7启动子表达系统是原核表达的首选,对多数小分子量基因能较好表达,但较大外源基因效果不好,而目前通过原核增强子样序列对促进分子量相对较大外源基因表达研究不多。从微生物基因组中寻找新的原核增强子样序列不仅对改善原核表达系统有一定的实用价值,而且为原核增强子样序列的调控理论研究奠定基础。本研究工作包括4个部分：（1）增强样序列检测载体的构建；（2）含增强子样序列菌株的筛选及其载体鉴定；（3）含增强子样序列菌株报告基因表达检测及序列分析；（4）增强子样序列的功能区域研究。（1）增强子样序列检测载体构建本研究以人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus, HPV）主要衣壳蛋白基因L1（或L1截短序列L11）与氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase, CAT）连接为融合报告基因,构建了两种分子量大小不同增强子样序列检测载体。将L1-pMD18-T/DH5α和CAT-pET21a/DH5α菌株质粒抽提,酶切连接构建增强子样序列检测载体Ll-CAT-pET21A;之后,通过PCR扩增得到L1的截短序列L11,并重组到CAT-pET21a,构建检测载体L11-CAT-pET21A。经酶切鉴定与测序结果表明两个重组载体构建正确。为后面可进行筛选研究,首先对检测菌株进行了功能测试。将两重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）,测定其氯霉素生长浓度皆为34μg/mL,且报告基因L1-CAT在L1-CAT-pET21a/BL21重组菌株蛋白表达没有明显条带,而在L1-CAT-pET21a/BL21中报告基因L11-CAT目的蛋白有明显条带。（2）含增强子样序列菌株的筛选及其载体鉴定采集污水或土壤,样品加入培养基中,富集培养混合菌,抽提基因组DNA,确定Sau3A I酶切基因组的最佳条件。将基因组DNA酶切片段插入两种检测载体,构建多个基因文库。经氯霉素初步筛选发现3株重组菌株：其中ER1-L1-CAT-pET21a/BL21和ER2-L1-CAT-pET21a/BL21重组菌氯霉素抗性提高至检测菌株的5倍；而ER3-L11-CAT-pET21a/BL21重组菌氯霉素抗性提高至检测菌株的11倍。酶切鉴定及测序结果表明：ERl-L1-CAT-pET21a和ER2-L1-CAT-pET21a含有插入序列,但检测载体骨架部分发生缺失突变；而另一载体ER3-L11-CAT-pET21a有插入序列,且检测载体骨架没有缺失突变。（3）含增强子样序列菌株报告基因表达检测及序列分析将筛选获得重组菌株经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测,结果发现：ER3-L11-CAT-pET21 a/BL21诱导L11-CAT融合蛋白表达,该菌株的融合报告基因蛋白表达提高至检测菌株的2.26倍；而另外两株重组菌株ER1-L1-CAT-pET21a/BL21和ER2-L1-CAT-pET21 a/BL21诱导表达,在85kDa处没有明显条带,但在45-66.2kDa之间有明显条带,这与载体鉴定中发现重组载体缺失突变的结果相符。将ER1序列和ER2序列重新构建到L11-pET21a,结果两条序列分别使L11蛋白表达提高到L11-pET21a/BL21菌株的1.78倍和1.37倍。在NCBI的数据库中,序列分析表明：1)ERl没有同源性较高的相似序列,其序列的229,-4.11bp与多种原核生物的同源性高达90%,序列412-517bp与嗜水气单胞菌同源性达到77%；2)ER2与嗜水气单胞菌的基因同源性达到100%；3)与ER3同源性最高的是蜡状芽孢杆菌,达到71%。此外,转录结合位点的预测显示这些序列都有多个转录因子结合位点,可与多种转录因子结合：同时保守区域的推测表明：ER1有两个保守区域,而ER3有一个保守区域。（4）增强子样序列的功能区域研究为确定增强子样序列ER1和ER3的功能区域,本研究采用缺失突变的分析方法,结果显示： ER1功能区域为117-317bp,而ER3功能区域为1～265bp。对ER1117-317和ER31-26s功能区域的原核转录因子及其结合位点在线软件预测研究发现：两个序列都有多个转录因子结合位点,其中ER31-265功能区域的转录因子及其结合位点皆较ER1117-317功能区域多。本研究成功地从样品基因组DNA中筛选出具有一定增强蛋白表达功能的3条增强子样序列,并对它们进行了序列分析,采用缺失突变的方法初步确定了ER1和ER3的功能区域,预测了功能区域的原核转录因子及其结合位点,为后期原核增强子样序列的理论研究和实际应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语索引
• 第一章 绪论
• 1.1 增强子
• 1.2 增强子的作用机制
• 1.3 原核增强子样序列在原核生物中的表达调控
• 1.3.1 病毒基因组的原核增强子样序列
• 1.3.2 原核生物基因组的原核增强子样序列
• 1.4 增强子样序列筛选研究
• 1.5 增强子样序列目前的应用
• 1.6 本论文研究的目的及意义
• 第二章 增强子样序列检测载体构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组亚克隆载体的鉴定
• 2.2.2 L11（Nde Ⅰ/BamH Ⅰ）基因的扩增
• 2.2.3 重组L11-CAT-pET21a载体的双酶切鉴定
• 2.2.4 重组L1-CAT-pET21a载体的酶切鉴定
• 2.2.5 检测菌株氯霉素抗性
• 2.2.6 检测菌株融合报告基因表达
• 2.3 讨论
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 融合报告基因的设计思路
• 2.4 小结
• 第三章 增强子样序列筛选及其序列分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 检测载体的酶切和去磷酸化
• 3.2.2 基因组酶切
• 3.2.3 基因文库的构建
• 3.2.4 含增强子样序列的菌株筛选
• 3.2.5 增强子样序列分析
• 3.2.6 ER1和ER2增强Lll基因蛋白表达检测
• 3.2.7 重组载体ER1-L11-pET21a和ER2-L11-pET21a酶切鉴定
• 3.2.8 检测含增强子样序列ER1和ER2的重组菌诱导L11蛋白表达
• 3.3 讨论
• 3.3.1 增强子样序列菌株的筛选分析
• 3.3.2 融合报告基因的表达分析
• 3.3.3 增强子样序列测定与同源性检索分析
• 3.3.4 增强子样序列的TFs结合位点及其TFs预测
• 3.4 小结
• 第四章 增强子样序列的功能区域研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 增强子样序列ER1缺失突变体载体构建
• 4.2.2 增强子样序列突变菌株L11蛋白表达
• 4.2.3 增强子样序列功能区域的微生物转录因子及其结合位点
• 4.3 讨论
• 4.3.1 增强子样序列的功能活性区域
• 4.3.2 增强子样序列转录因子及其结合位点
• 4.4 小结
• 第五章 全文总结
• 第六章 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文及参与项目目录