骨髓间充质干细胞体外培养诱导分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

论文摘要

背景：感音性神经性耳聋在临床上很常见，主要由衰老、噪声、耳毒性药物、外伤、感染、肿瘤、遗传性疾病和免疫性疾病等疾病引起的耳蜗毛细胞损害所致。常可引起永久性的听力下降，治疗非常困难。随着干细胞研究的深入，通过于细胞移植或再生补偿毛细胞的损失，是迄今研究最活跃的领域之一。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells MSCs）是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类成体干细胞，这类细胞具有高度自我更新和多向分化的潜能。在不同条件下MSCs可以定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞。MSCs来源广泛，取材方便，不受医学伦理学和法律的制约；且具有免疫源性弱的特点。我们探索MSCs诱导分化为内耳毛细胞的可能性，试图为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供实验基础。方法：实验用贴壁法提取大鼠MSCs，体外培养纯化到第四代后，选取表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT-3）、全反式维甲酸（ATRA）等因子，组合成不同的诱导条件，加入MSCs基础培养液（2％FBS+1％N2+低糖DMEM液）中，诱导骨髓间充质干细胞分化。在诱导过程中，动态观察细胞形态变化，并用免疫细胞化学方法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinⅥ、pax-2、nestin、P27kip1是否在诱导后的细胞表达。结果：1．EGF+IGF-1和EGF+IGF-1+BDNF+ATRA诱导组，细胞形态呈短梭形样、方形样，未形成突触。前组myosinⅥ表达弱阳性、pax-2表达中度阳性；后组myosinⅥ和pax-2表达均呈中度阳性。且nestin和P27kip1也阳性表达。2．加入NT-3、bFGF和BDNF的诱导组，细胞变圆或变细长，逐渐伸出突触，部分细胞形成网络状、大环状结构；有突触的细胞，nestin表达中度阳性，而其他渐变的细胞表达弱或无；这种变化在加入NT-3和bFGF的诱导组尤其显著。4．同一诱导条件下，密集区细胞先变圆，以后如有空间逐渐伸出多个短突触，否则仍维持圆形；不密集区细胞先变细长，以后两端逐渐形成长突触。5．未诱导组骨髓间充质细胞，nestin表达弱阳性；细胞呈梭形样，边界模糊，碎片增多。结论：1．骨髓间充干细胞可诱导分化为毛细胞前体细胞和神经前体细胞。2．EGF+IGF-1+BDNF+ATRA可作为较佳诱导组，使骨髓间充干细胞分化为毛细胞前体细胞。3．NT-3、bFGF和BDNF的参与能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经前体细胞。其中NT-3和NbFGF有很强的神经诱导性，IGF-1、BDNF的神经诱导性弱。4．细胞密度也是细胞周围环境之一，可影响干细胞的分化方向。5．骨髓间充干细胞具有自发分化为神经前体细胞的潜能，但需要在外加诱导因子的作用下才能进一步分化成熟。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 实验结果
• 3.1 骨髓间充质干细胞生长特性
• 3.2 骨髓间充质干细胞诱导后形态变化
• 3.3 各组细胞免疫细胞化学染色结果
• 3.4 EGF+IGF-1组、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组可诱导骨髓间充 质干细胞分化为耳蜗毛细胞前体细胞
• 3.5 bFGF、NT-3、BDNF可诱导骨髓间充质细胞向神经细胞分化
• 3.6 bFGF和NT-3的神经诱导性
• 3.7 IGF-1对诱导骨髓间充质细胞向神经分化的作用
• 3.8 细胞的密度对骨髓间充质干细胞分化的影响
• 3.9 未诱导组骨髓间充质干细胞的特征
• 讨论
• 4.1 贴壁法纯化骨髓间充质干细胞的技巧
• 4.2 骨髓间充质干细胞代数的选择
• 4.3 骨髓间充干细胞分化为毛细胞前体细胞的诱导条件
• 4.4 5NT-3和bFGF有很强的神经诱导性
• 4.5 IGF-1、BDNF的神经诱导性弱
• 4.6 细胞密度影响干细胞的分化方向
• 4.7 骨髓间充干细胞具有自发分化为神经前体细胞的潜能
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 致谢