酒精耐受半纤维素降解菌筛选鉴定及相关基因克隆

论文摘要

利用秸秆生产酒精不但可以缓解能源危机,还能减轻粮食生产酒精造成的粮食紧张问题。应用混合发酵方法降解秸秆生产酒精的过程中,酒精的积累会对木质纤维素降解菌和降解酶产生抑制作用,目前很少有木质纤维素降解菌酒精耐受性的报道,对木质纤维素降解酶的酒精耐受性更是几乎没有资料提及。本实验针对木质纤维素降解菌的酒精耐受性问题,进行了菌种和木聚糖酶的一系列研究。通过筛选培养基和酒精平板实验等方法,筛选到一株能耐受一定浓度酒精且可以高产木聚糖酶的细菌DT83。经生理生化鉴定和16SrDNA鉴定,确定DT83为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。为了研究短小芽孢杆菌DT83产木聚糖酶的发酵条件和酒精耐受度,本实验首先对该菌的生长条件进行优化,得到了该菌的最适培养条件。然后对短小芽孢杆菌DT83酒精耐受度分析得出:短小芽孢杆菌DT83在固体平板上可以耐受10%酒精,在液体培养基中可以耐受8%酒精,明显好于大肠杆菌的酒精耐受度,甚至达到某些酿酒酵母的耐受程度。利用液体发酵培养对DT83的产木聚糖酶条件进行分析得出,短小芽孢杆菌DT83产木聚糖酶的最适诱导碳源为木聚糖,最佳单因子氮源为蛋白胨,最适产酶温度为28℃,最适培养基pH值为8.5左右。实验选取4种氮源进行正交优化分析得出最佳的氮源组合为蛋白胨0.2%、酵母粉0.4%、硝酸铵0.4%、硫酸铵0.6%。DT83所产的木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.5。木聚糖酶的酒精耐受性分析得出,在5%的酒精溶液中该木聚糖酶依然可以保持90%以上的活性,在10%的酒精溶液中可以保持75%以上的酶活,这是该领域首次提及酶的酒精耐受性问题。本实验克隆到了DT83的木聚糖酶基因（xynA）,序列分析结果表明这是一条新的序列。将xynA构建到pET-28a（+）载体上转化大肠杆菌（E. coli）BL21进行非融合表达。对转化子分泌胞外木聚糖酶的产酶条件分析得出:转化子产木聚糖酶的高峰在48 h60 h,并且转化子的较高产酶能力可以保持20 d以上;转化子产酶的最佳IPTG诱导浓度为0.02 mmol/L,最适产酶温度为25℃28℃;转化子木聚糖酶活最高可达到250 IU以上,其中胞外可达到208 IU。该转化子胞外酶活远远超过其他木聚糖酶外源表达的胞外酶活,为目前报道的国内外最高水平。利用SDS-PAGE分析转化子表达木聚糖酶情况得出:转化子胞内在4 h即可表达出目的蛋白,胞内目的蛋白表达量在12 h达到高峰;从SDS-PAGE电泳图可以看出转化子分泌的木聚糖酶分子量与短小芽孢杆菌DT83分泌的木聚糖酶分子量大小一致,与蛋白预测的22.7 kD相符。本文对产木聚糖酶的菌株和木聚糖酶在酒精耐受方向的研究,为利用木质纤维素生产酒精开辟了一个新的研究方向。同时,本试验研究了木聚糖酶基因的克隆和表达,实验得到的转化子能高效的合成木聚糖酶,并且大量分泌到胞外,胞外酶活值在该方向上处于国内外领先的水平,为木聚糖酶基因工程菌在工业上的应用迈出了重要的一步。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景及意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 木聚糖
• 1.2.2 木聚糖酶和木聚糖酶基因
• 1.2.3 木聚糖酶应用的研究
• 1.2.4 纤维质原料生产酒精现状
• 1.2.5 耐受酒精微生物研究现状
• 1.3 课题来源及主要研究内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 主要研究内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 土样
• 2.1.2 菌株及载体
• 2.1.3 实验药品
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 试剂配制
• 2.1.7 主要仪器及耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 木聚糖酶测定方法
• 2.2.2 菌种筛选
• 2.2.3 菌种鉴定
• 2.2.4 DT83 生长条件优化
• 2.2.5 DT83 酒精耐受性研究
• 2.2.6 DT83 发酵产酶条件优化
• 2.2.7 DT83 所产木聚糖酶性质研究
• 2.2.8 木聚糖酶基因（xynA）克隆
• 2.2.9 木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.10 原核表达条件优化
• 2.3 本章小结
• 第3章 耐受酒精的半纤维素降解菌筛选和鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 菌种的分离和筛选
• 3.2.1 木糖标准曲线绘制
• 3.2.2 菌株初筛
• 3.2.3 菌株复筛
• 3.3 对DT83 的菌种鉴定
• 3.3.1 形态学观察
• 3.3.2 生理生化鉴定
• 3.3.3 16SrDNA鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 菌种筛选地点和方法的选择
• 3.4.2 菌种鉴定方法的讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 DT83 生长条件优化及菌体酒精耐受性分析
• 4.1 引言
• 4.2 短小芽孢杆菌DT83 生长条件优化
• 4.2.1 生长曲线绘制
• 4.2.2 氮源对DT83 生长的影响
• 4.2.3 碳源对DT83 生长的影响
• 4.2.4 正交优化分析氮源对DT83 生长的影响
• 4.2.5 pH对DT83 生长的影响
• 4.2.6 温度对DT83 生长的影响
• 4.3 短小芽孢杆菌DT83 酒精耐受性分析
• 4.3.1 DT83 在平板上的酒精耐受性分析
• 4.3.2 DT83 在液体培养基中的酒精耐受度分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 生长条件优化取样时间点的选择
• 4.4.2 培养条件优化中的问题
• 4.4.3 酒精耐受性中存在的问题
• 4.5 本章小结
• 第5章 DT83 产酶条件优化及木聚糖酶酶学性质
• 5.1 引言
• 5.2 短小芽孢杆菌DT83 发酵产木聚糖酶的研究
• 5.2.1 DT83 产木聚糖酶曲线
• 5.2.2 不同氮源对DT83 产木聚糖酶的影响
• 5.2.3 不同碳源对DT83 产木聚糖酶的影响
• 5.2.4 氮源对DT83 产木聚糖酶影响的正交优化试验
• 5.2.5 不同pH对DT83 产木聚糖酶的影响
• 5.2.6 培养温度对DT83 产木聚糖酶的影响
• 5.3 木聚糖酶酶学性质
• 5.3.1 木聚糖酶酶促反应的最佳温度
• 5.3.2 木聚糖酶反应的最适pH值
• 5.3.3 木聚糖酶的酒精耐受性
• 5.3.4 SDS-PAGE电泳分析短小芽孢杆菌DT83 产木聚糖酶情况
• 5.4 讨论
• 5.4.1 DT83 产酶条件优化中的问题
• 5.4.2 木聚糖酶酒精耐受性的问题
• 5.4.3 SDS-PAGE分析木聚糖酶的讨论
• 5.5 本章小结
• 第6章 木聚糖酶基因（xynA）的克隆及表达
• 6.1 引言
• 6.2 木聚糖酶基因的克隆及序列分析
• 6.2.1 木聚糖酶基因的克隆
• 6.2.2 木聚糖酶基因序列分析
• 6.2.3 木聚糖酶蛋白序列分析
• 6.3 非融合表达载体的构建
• 6.3.1 xynA基因PCR反应结果
• 6.3.2 目的基因与载体的连接
• 6.3.3 菌落PCR结果
• 6.4 木聚糖酶基因在大肠杆菌BL21 中的表达
• 6.4.1 含有目的基因的载体转化大肠杆菌BL21
• 6.4.2 转化子中木聚糖酶基因的表达
• 6.5 转化子产木聚糖酶条件优化
• 6.5.1 转化子胞外木聚糖酶活随时间变化情况
• 6.5.2 IPTG浓度对转化子木聚糖酶表达的影响
• 6.5.3 温度对转化子木聚糖酶表达的影响
• 6.5.4 转化子木聚糖酶活性最高数值的测量
• 6.6 SDS-PAGE电泳分析转化子产木聚糖酶情况
• 6.6.1 转化子胞内蛋白表达情况
• 6.6.2 转化子胞外蛋白表达情况
• 6.7 讨论
• 6.7.1 DT83 木聚糖酶基因的克隆及分析的讨论
• 6.7.2 非融合表达天然蛋白载体的构建
• 6.7.3 木聚糖酶基因在大肠杆菌BL21 表达的讨论
• 6.7.4 关于原核表达条件优化的讨论
• 6.8 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢