口蹄疫A型病毒A/WH/09株结构蛋白主要B细胞表位的筛选及鉴定

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、烈性、高度接触性传染病。FMDV属于小核糖核酸病毒科、FMDV属,可分为A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaⅠ等7个血清型,各血清型间无交叉免疫保护。FMDV B细胞表位是病毒抗原的免疫活性区,可以被B细胞受体（B cell receptor,BCR）识别进而刺激机体产生特异性抗体。本研究运用生物信息学技术结合分子生物学方法对FMDV A/WH/09病毒株P1结构蛋白上主要B细胞表位进行筛选和分析,为FMDV的结构蛋白免疫特性与功能研究以及表位疫苗的设计等提供了参考依据。本试验从FMD A/WH/09病毒株的乳鼠胴体中提取总mRNA,根据GenBank中已经发表的其他FMD A型病毒的结构蛋白P1基因序列,设计PCR扩增引物,利用RT-PCR技术扩增P1基因,通过将产物与pGEM-T easy载体连接,构建重组克隆载体pGEM-T-P1、并进行序列测定。基因测序结果表明,本试验所获得的P1基因核苷酸序列和所编码氨基酸序列与GenBank中收录的其他A型FMDV蛋白P1基因同源性较高,运用生物信息学软件对P1结构蛋白上潜在的B细胞表位进行预测,并人工合成相应的表位肽段。根据测序结果,分别重新设计并合成原核表达引物,并以重组质粒pGEM-T-P1为模板,进行PCR扩增,获得P1基因片段。原核表达载体pET-30a（+）和目的基因P1扩增产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后与T4连接酶连接,构建重组原核表达载体pET-30a/ P1,并将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中,用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明,P1基因片段在大肠杆菌中成功表达,结构蛋白P1分子量大小为80.754kDa左右,与预期的大小吻合,可溶性分析表明所表达的目的蛋白以包涵体形式存在。将包涵体纯化后,与弗氏佐剂乳化配制疫苗,免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,获得了兔抗FMDV P1蛋白阳性血清,经间接ELISA和Western Blot分析表明效价达到了1:12800以上,且具有较高的特异性。以人工合成的抗原表位肽段作为抗原,制备的多克隆抗体作为一抗,辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG作为二抗,参照常规间接ELISA方法对潜在表位进行筛选鉴定。结果显示,结构蛋白VP1-3: PNGAPEAALDNTSNPTA（90～106aa）;VP1-4:YNGNSKYSAPATRRGDLGS（130-148aa） VP3-1: LVTTDPKTADPAYG（14～27aa）;VP3-6: VPPGVTTPPDTPERAAHCI（126～144aa）具有较好的反应原性,为其优势B细胞表位。对A型FMDV流行毒株主要B细胞表位的筛选鉴定,为进一步研发FMD A型多表位疫苗奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究抗原表位的方法
• 1.1.1 研究B 细胞抗原表位的方法
• 1.1.2 研究T 细胞抗原表位的方法
• 1.2 FMDV 抗原表位的研究进展
• 1.2.1 A 型FMDV 的抗原位点
• 1.2.2 O 型FMDV 的抗原位点
• 1.2.3 C 型FMDV 的抗原位点
• 1.2.4 Asia1 型FMDV 的抗原位点
• 1.3 FMD 表位疫苗的研究进展
• 1.4 表位疫苗的分类
• 1.4.1 合成肽疫苗
• 1.4.2 重组表位疫苗
• 1.4.3 表位核酸疫苗
• 1.5 表位疫苗的应用
• 1.5.1 病毒性疾病
• 1.5.2 微生物与寄生虫感染
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 FMDV A/WH/09 株结构蛋白基因的克隆测序及B 细胞抗原表位预测
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与乳鼠
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 引物序列
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒复壮
• 2.2.2 病毒RNA 的提取
• 2.2.3 cDNA 合成
• 2.2.4 P1 基因的PCR 扩增
• 2.2.5 P1 基因的克隆与鉴定
• 2.2.6 P1 结构蛋白特性分析与B 细胞抗原表位的预测
• 2.2.7 B 细胞表位肽段的合成
• 2.3 结果
• 2.3.1 P1 基因的RT-PCR 扩增
• 2.3.2 阳性克隆质粒的PCR 和酶切鉴定
• 2.3.3 P1 基因的序列测定及比较分析
• 2.3.4 P1 蛋白的二级结构分析及B 细胞表位预测
• 2.4 讨论
• 第三章 FMDV A/WH/09 株结构蛋白 P1 基因的原核表达及其多克隆抗体的制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 主要溶液
• 3.1.6 引物的设计与合成
• 3.2 方法
• 3.2.1 目的基因的扩增
• 3.2.2 目的片段和载体的酶切与回收
• 3.2.3 重组表达质粒的构建和鉴定
• 3.2.4 重组表达质粒的诱导表达和条件优化
• 3.2.5 表达蛋白的可溶性分析
• 3.2.6 表达蛋白的纯化
• 3.2.7 表达蛋白的Western blot 分析
• 3.2.8 多克隆抗体的制备
• 3.2.9 多克隆抗体的鉴定
• 3.2.10 多克隆抗血清效价的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 原核表达载体的构建及鉴定
• 3.3.2 P1 基因的表达与表达条件的优化
• 3.3.3 表达蛋白的可溶性分析与纯化
• 3.3.4 表达蛋白的Western blot 鉴定
• 3.3.5 多克隆抗体的鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 FMDV A/WH/09 病毒株结构蛋白 P1 上 B 细胞抗原表位的筛选
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 抗原表位肽段
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验所用仪器和材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验所用溶液及其配制
• 4.2.2 抗原表位肽段样品的稀释
• 4.2.3 抗原表位肽段样品最佳稀释浓度的确定
• 4.2.4 抗原表位筛选
• 4.3 P1 抗原表位的筛选结果
• 4.4 讨论
• 第五章 研究结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历