清络饮和温络饮抗类风湿性关节炎滑膜血管新生作用的比较研究

论文摘要

目的：研究比较清络饮和温络饮对RA滑膜血管新生的干预作用并探索相关机制,为指导RA临床的合理应用提供实验依据,也为中医络病学说的科学内涵研究提供方法学参考。方法：SD大鼠清络饮、温络饮水煎液连续灌胃五次后,末次灌胃后1h腹主动脉采血分离血清,制得清络饮含药血清（QX）温络饮含药血清（WX）。分设以下组：正常鼠血清组（Con）、IL-1β诱导正常鼠血清组（Mod）、QX（5%、10%、20%）组, WX（5%、10%、20%）组。30%乙醇回流提取清络饮、温络饮制得清络饮醇提物（QL）、温络饮醇提物（WL）。分设以下组：空白组（Con）、IL-1β诱导组（Mod）、IL-1β诱导+QL（2、4、8 mg/ml）组、IL-1β+WL（2、4、8、16、32 mg/ml）组。将不同浓度的清络饮、温络饮分别与IL1-β诱导的RA-HFLS及未诱导的HUVEC共孵育,采用MTS比色法检测细胞增殖活性,以观察清、温络饮对RA-HFLS和HUVEC增殖的影响；通过Transwell双室培养板观察清、温络饮RA-HFLS和HUVEC趋化性迁移的影响；采用细胞外基质主要成分之一FN包被96孔培养板,考察清、温络饮对RA-HFLS和HUVEC细胞与细胞外基质黏附作用的影响；通过基质胶包被的96孔板来观察清、温络饮对RA-HFLS和HUVEC管腔形成能力的影响;以及通过在体实验观察清、温络饮对小鼠基质胶栓子中血管形成的影响；ELISA（?）去检测清、温络饮对RA-HFLS分泌的血管新生相关细胞因子（VEGF、Ang1、Ang2、TNFα、IL-17）及HUVEC血管新生相关受体蛋白VEGFR2和Tie2表达水平的影响的影响。结果1.清、温络饮对RA-HFLS增殖、迁移、黏附及血管新生相关因子的影响1.1.清、温络饮对IL1-β诱导的RA-HFLS增殖的影响与空白对照组相比,IL-1β可明显提高细胞的增殖活性;QX组对IL-1β诱导的RA-HFLS增殖无明显影响；WX组随着浓度的增大,抑制作用逐渐增强,Wx20可显著抑制RA-HFLS的增殖（P<0.05）;QL在较低浓度2～8 mg/ml即可抑制RA-HFLS的增殖,而WL在高剂量16～32 mg/ml组才可显著抑制RA-HFLS的增殖（P<0.01或P<0.05）,且呈现剂量依赖性：同时TP10、50组亦可剂量依赖性的抑制RA-HFLS的增殖（P<0.01）1.2.清、温络饮对RA-HFLS迁移的影响与空白对照组相比,VEGF可明显提高RA-HFLS细胞的迁移数量；随着QX浓度增大,QX20组可显著抑制其迁移（P<0.05）随着Wx浓度增大,Wx10,20组均可显著抑制其迁移（P<0.05或P<0.01）;同时QL可剂量依赖性的抑制RA-HFLS细胞的迁移（P<0.05或P<0.01）；WL组随浓度增大WL8-32组均可显著抑制其迁移。TP组随浓度增大,可剂量依赖性的抑制RA-HFLS的迁移。1.3.清、温络饮对RA-HFLS黏附的影响与空白组相比,RA-HFLS对FN有较强的黏附能力（P<0.01）；同时IL-1β诱导可显著增加RA-HFLS对FN的黏附（P<0.05）;QX,WX随浓度的增大,对RA-HFLS黏附能力均无显著影响。QL, WL随浓度的增大,QL4、QL8, WL16、WL32组均可显著降低RA-HFLS黏附能力（P<0.05或P<0.01）。TP浓度的增大,TP10、50组可显著降低RA-HFLS黏附能力（P<0.01）。1.4.清、温络饮对RA-HFLS分泌的血管新生相关因子（TNFα、IL-17、VEGF、Ang1、Ang2）的影响（1）对炎性因子TNFα、IL-17水平的影响与空白对照组相比,IL1-β诱导组可增加RA-HFLS上清中TNFα、IL-17水平,QX对TNFα的影响无显著性差异,Qx20能显著降低IL-17水平,而Wx20组较IL1-β诱导组TNFα、IL-17水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；QL4～8、WL16～32组可显著抑制TNFα、IL-17的表达（P<0.05或P<0.01）TP可剂量依赖性的抑制RA-HFLS分泌IL-17,而TP10、50组对TNFα的抑制作用具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。（2）对血管新生相关因子VEGF, Ang1, Ang2的影响与空白对照组相比,IL1-β诱导组可增加RA-HFLS上清中VEGF、Ang1、Ang2水平,QX、WX对VEGF、Ang1、Ang2的影响无显著性差异。QL组对RA-HFLS分泌Ang2无明显影响,QL4～8组可显著抑制上清中VEGF、Ang1水平（P<0.05或P<0.01）;WL8～32组亦可显著抑制上清中Ang1水平,而只有WL32组可明显抑制VEGF、Ang2的表达。TP组可剂量依赖性的降低VEGF、Ang1水平（P<0.05或P<0.01）。只有TP50组Ang2水平显著降低（P<0.05）。2.清、温络饮对HUVEC增殖,迁移,黏附,管腔形成及血管新生相关受体蛋白VEGFR2和Tie2表达水平的影响2.1.清、温络饮对HUVEC增殖的影响浓度增大,Qx10和QX20组均可显著抑制HUVEC增殖；Wx组剂量依赖性的抑制其增殖（P<0.01）, QL、WL组随着浓度增大,QL2、QL4, WL16、WL32均可显著抑制HUVEC增殖（P<0.01）,但是同剂量组相比,QL较WL对HUVEC增殖的抑制作用强。TP10、50组均可显著抑制RA-HFLS的增殖（P<0.01）。2.2.清、温络饮对HUVEC迁移的影响与空白对照组相比,VEGF可明显提高HUVEC细胞的迁移数量；随着QX、WX浓度增大,QX20、WX20组可显著抑制其迁移（P<0.05或P<0.01）;QL组可剂量依赖性的抑制其迁移（P<0.05或P<0.01）；随着WL浓度增大WL8-32组的迁移作用明显降低,而TP组可剂量依赖性的抑制RA-HFLS的迁移。2.3.清、温络饮对HUVEC黏附的影响与空白组相比,HUVEC对FN有较强的黏附能力（P<0.01）；同时IL-1β诱导可显著增加HUVEC对FN的黏附（P<0.05）; QX, WX随浓度的增大,对HUVEC黏附能力均无显著影响。而QL可剂量依赖性的抑制HUVEC的黏附（P<0.05或P<0.01）,随着WL浓度的增大,WL16、WL32可显著降低HUVEC黏附能力（P<0.05或P<0.01）。同时TP组随着浓度的增大,均可显著降低HUVEC黏附能力（P<0.01）。2.4.清、温络饮对HUVEC管腔形成的影响与空白对照组相比,VEGF诱导可显著增加HUVEC在基质胶上的管腔形成,QL、WL、TP组随着浓度的增加均可剂量依赖性的抑制HUVEC的管腔形成（P<0.01）。2.5.清、温络饮对HUVEC血管新生相关受体蛋白VEGFR2和Tie2表达水平的影响与空白对照组相比QX, WX均可剂量依赖性的促进HUVEC的VEGFR2、Tie2的表达（P<0.01）, QL, WL组随浓度增大,Tie2的表达水平均呈上升趋势,除WL2组外,均具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）; QL8、WL16～32组可显著促进VEGFR2的表达（P<0.01）：TP组与空白对照组相比TP10、TP50可显著上调Tie2的表达水平（P<0.01）,而只有高剂量的TP才可显著促进VEGFR2的表达。3.清、温络饮30%乙醇提取物对在体小鼠基质胶栓子中血管形成的影响与空白对照组相比,VEGF诱导组见基质胶内部可见大量血管内皮细胞浸润,且有管样结构形成,说明VEGF有促进血管新生的作用；QL8, WL32, TP50组较VEGF诱导组相比,血管内皮细胞浸润均明显减少。4.结论根据国内外的最新研究进展,借助体外培养的RA-HFLS和HUVEC细胞模型以及在体的小鼠基质胶栓子模型成功模拟了实验性RA滑膜血管新生病理过程,并以此为基础得到如下结论：（1）清、温络饮均具有显著的RA滑膜血管新生抑制作用,但清络饮的作用显著强于温络饮。（2）清、温络饮对RA滑膜炎症的抑制作用可能是通过抑制RA-HFLS的增殖、迁移和黏附及炎症因子TNFα、IL-17和促血管新生因子VEGF、Ang1的分泌来实现的；而对血管新生的抑制作用则可能与其对HUVEC增殖、迁移、黏附的抑制以及对血管新生相关受体Tie2、VEGFR2水平的有效调控有关。（3）清络饮与温络饮二者对RA滑膜血管新生的作用环节和靶点相同,但清络饮作用强度显著高于同浓度的温络饮,而阳性对照药雷公藤甲素抗血管新生作用明确,可显著抑制上述滑膜血管新生的主要病理环节和靶点。（4）清、温络饮30%醇提物对滑膜炎症和血管生成作用与整体动物实验较为一致,而清、温络饮含药血清的作用在本实验中表现较弱。

论文目录

• 目录
• 文献综述
• 1 血管新生与RA
• 2 RA滑膜血管新生的调控因子
• 3 RA滑膜血管新生的实验研究方法
• 4 RA滑膜血管新生与中医药
• 5 小结
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略表
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 对RA-HFLS增殖、迁移、黏附、血管新生相关因子及下游信号蛋白的影响
• 3.1.1 清、温络饮对IL1-β诱导的RA-HFLS增殖的影响
• 3.1.2 清、温络饮对RA-HFLS迁移的影响
• 3.1.3 清、温络饮及雷公藤甲素对RA-HFLS黏附的影响
• 3.1.4 清、温络饮对RA-HFLS上清中血管新生相关因子的影响
• 3.1.5 清、温络饮对RA-HFLS MAPKs通路信号蛋白表达水平的影响
• 3.2 对HUVEC增殖、迁移、黏附、管腔形成、血管新生相关受体蛋白表达水平及下游信号蛋白的影响
• 3.2.1 清、温络饮对HUVEC增值的影响
• 3.2.2 清、温络饮对HUVEC迁移的影响
• 3.2.3 清、温络饮对HUVEC黏附的影响
• 3.2.4 清、温络饮对HUVEC管腔形成能力的影响
• 3.2.5 清、温络对HUVEC血管新生相关受体蛋白VEGFR2和Tie2水平的影响
• 3.2.6 清、温络饮及雷公藤甲素对HUVEC MAPKs通路信号蛋白表达水平的影响
• 3.3 清、温络饮对在体小鼠基质胶栓子中血管形成的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 特别感谢
• 个人简历