牛脂肪代谢相关基因遗传分析及其与秦川牛经济性状关联分析

论文摘要

本研究以秦川牛、南阳牛、郏县红牛、夏南牛、鲁西牛、安格斯牛、安西牛7个品种的787个个体为材料,采用PCR-SSCP、PCR-RFLP、DNA测序技术及DNA序列分析技术,结合生物信息学方法,研究了影响牛脂肪代谢的leptin、MC4R、ApoA1、ApoA4 4个基因的全序列及MC4R和ApoA4基因的5’非翻译区及3’侧翼区的遗传变异,以探讨试验牛群的遗传结构和遗传多样性。测定了其中101头秦川牛的胴体组成和肉质性状等主要经济指标,对以上基因的遗传突变位点与秦川牛部分经济性状进行关联分析,以期筛选出显著影响秦川牛肉质性状的功能基因或分子标记,并利用生物信息学方法初步分析了部分分子标记的作用机理,为秦川牛胴体、肉质等经济性状选育的分子标记辅助选择和优质高产新品系（种）培育提供科学依据。试验得到以下主要结果:1、采用PCR-SSCP及测序的方法,研究了牛leptin基因第2、3外显子的遗传变异情况。在leptin基因第2外显子发现73 C>T的突变位点,7个试验牛群体在该位点均为中度多态;秦川牛、鲁西牛、南阳牛、郏县红牛四个群体在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,夏南牛、安格斯牛和安西牛在该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态;该位点多态性与秦川牛宰前活重、背膘厚极显著相关（P<0.01）,与眼肌面积显著相关（P<0.05）,CC型和CT型的宰前活重、背膘厚极显著高于TT型（P<0.01）,CC型的眼肌面积显著高于CT型和TT型（P<0.05）;生物信息学研究发现该位点突变导致了编码蛋白的精氨酸突变为半胱氨酸,导致蛋白二级结构24、146处的α螺旋丢失和20、144处的β折叠丢失,改变了三级结构中β转角的空间位置,这些变化可能与该基因功能的改变有关;编码蛋白的氨基酸改变导致了疏水性结构改变,半胱氨酸编码蛋白的疏水性最小值为-1.689,位于第102个氨基酸处,精氨酸编码蛋白的疏水性最小值为-2.222,位于第29个氨基酸处,未引起最大值的改变;突变并未引起该蛋白松散度的改变。leptin基因第3外显子前段扩增片段呈现AA和AB两种带型,AA型在第3外显子95 bp处的C变为T,AB型第3外显子在267 bp处的T变为C,在252 bp和351 bp处的C均变为T;该位点在试验牛群体中均为低度多态、处于Hardy-Weinberg平衡状态,该位点不同基因型秦川牛个体之间与秦川牛肉质性状间无显著差异（P>0.05）。leptin基因第3外显子后段扩增片段没有多态性。2、生物信息学分析表明,不同物种MC4R基因编码蛋白质的氨基酸序列在中间部分的结构较为相似。通过DNA池测序技术发现牛MC4R基因存在5’端-293C>G、-193A>T、-192T>G、-129A>G、-84T>C以及位于外显子1069 C>G的突变位点。通过PCR-RFLP检测发现MC4R基因-293C>G和-129A>G位点为连锁突变,秦川牛、鲁西牛、南阳牛、夏南牛、郏县红牛、安格斯牛在-129A>G位点处于中度多态,安西牛群体处于低度多态;安西牛在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,其他牛群均达到平衡状态;-129A>G多态位点与秦川牛宰前活重之间存在显著相关,GG型的个体在宰前活重上显著高于AA型和AG型（P<0.05）。7个试验牛群体在1069 C>G位点处于中度多态,且均处于Hardy-Weinberg平衡状态;1069 C>G多态位点与秦川牛宰前活重、胴体重、背膘厚、大理石花纹等级显著相关。GG型的宰前活重和胴体重显著高于CC型（P<0.05）而CG型与CC、GG型之间差异不显著（P>0.05）,GG、CG型的背膘厚显著高于CC型（P<0.05）,GG型的大理石花纹等级显著高于CC型（P<0.05）,而CG型与CC、GG型之间差异不显著（P>0.05）;1069 C>G位点突变导致了编码氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸,缬氨酸编码的蛋白二级结构在280处产生α螺旋丢失,281处β折叠丢失,无规则卷曲没有发生变化,没有改变蛋白的三级结构、疏水性及松散度。3、通过PCR-SSCP及测序分析,发现APOA1基因第411碱基处C>G的突变,该突变位于第二内含子,秦川牛、鲁西牛、夏南牛、郏县红牛在该位点中处于中度多态,南阳牛、安格斯牛、安西牛群体在该位点为低度多态;秦川牛在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,其他牛群均达到平衡状态;该位点与肉质和胴体性状无相关性。通过6个随机个体测序及比对发现,在ApoA1基因第1523碱基处T>G的突变,第1572碱基处C>A的突变,均发生在ApoA1基因第3外显子,但未引起氨基酸的变化。通过PCR-RFLP检测发现,ApoA1基因1523 T>G位点在鲁西牛、南阳牛、郏县红牛群体中为中度多态,在秦川牛、夏南牛、安格斯牛、安西牛群体中为低度多态;鲁西牛、南阳牛、郏县红牛在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,其他牛群均达到平衡状态;该多态位点与秦川牛背膘厚显著相关,GT型个体显著高于TT型个体（P<0.05）。ApoA1基因1572 C>A位点除安西牛外其他牛种均处于中度多态;秦川牛、夏南牛在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,其他牛群均达到平衡状态;该多态位点与秦川牛背膘厚显著相关,CC基因型显著高于AC型和AA型（P<0.05）。4、采用电子克隆（e-PCR）及反转录PCR（RT-PCR）,从秦川牛脂肪组织中克隆并鉴定了牛ApoA4基因cDNA的编码区,并用生物信息学方法对ApoA4蛋白进行了预测分析,发现该蛋白没有跨膜结构,在其20～21位氨基酸处很可能存在信号肽区域,并预测了其二级结构与三级结构。通过6个随机个体测序,并未发现该基因存在SNP位点。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 引言

1.2 牛脂肪代谢相关基因研究进展

1.2.1 过氧化物酶体增殖物激活受体基因

1.2.2 肪酸结合蛋白基因

1.2.3 脂联素基因

1.2.4 解偶联蛋白基因

1.2.5 脂肪分化相关蛋白基因

1.3 本试验研究基因的概况

1.3.1 Leptin 基因的研究概况

1.3.2 黒素皮质素受体4 基因

1.3.3 载脂蛋白

1.4 候选基因分析方法

1.4.1 候选基因的选择

1.4.2 获得用于扩增基因的引物序列

1.4.3 揭示候选基因内的多态性

1.4.4 选择用于进行候选基因分析的群体

1.4.5 候选基因与表型性状间的连锁分析

1.4.6 连锁关系的验证

1.5 家畜分子遗传标记技术

1.5.1 直接测序

1.5.2 单链构象多态性

1.5.3 变性高压液相色谱检测

1.5.4 SNP 芯片

1.6 生物信息学

1.6.1 基因的电子克隆

1.6.2 基因功能预测

1.6.3 蛋白质结构与功能预测

第二章牛LEPTIN 基因遗传变异及其与秦川牛经济性状的相关分析

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 牛主要经济性状指标

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要试剂和溶液的配制

2.2 试验方法

2.2.1 血液DNA 提取

2.2.2 DNA 质量检测

2.2.3 DNA 浓度检测及稀释

2.2.4 牛leptin 基因引物设计

2.2.5 PCR 反应

2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.7 PCR 扩增产物的回收纯化

2.3 统计分析

2.3.1 基因频率和基因型频率的计算

2.3.2 多态信息含量

2.3.3 纯合度和杂合度

2.3.4 Hardy-Weinberg 平衡检测

2.3.5 统计分析模型

2.3.6 生物信息学分析

2.4 结果与分析

2.4.1 DNA 提取结果

2.4.2 Leptin 基因LP1 引物扩增及SSCP 结果

T 多态位点遗传分析'>2.4.3 Leptin 基因第二外显子73 C>T 多态位点遗传分析

T 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>2.4.4 Leptin 基因第二外显子73 C>T 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

T 位点突变的生物信息学分析'>2.4.5 Leptin 基因第二外显子73 C>T 位点突变的生物信息学分析

2.4.6 Leptin 基因LP2 引物扩增及SSCP 结果

2.4.7 Leptin 基因LP2 扩增片段多态位点遗传分析

2.4.8 Leptin 基因 LP2 扩增片段多态位点与经济形状的关联分析

2.4.9 Leptin 基因LP3 引物扩增及SSCP 结果

2.5 讨论

2.5.1 PCR-SSCP 反应及测序

2.5.2 Leptin 基因的多态性

2.5.3 Leptin 基因多态位点与性状的关联分析

T 位点突变的生物信息学分析'>2.5.4 73 C>T 位点突变的生物信息学分析

2.6 小结

第三章牛MC4R 基因遗传变异及其与秦川牛经济性状的相关分析

3.1 试验材料与方法

3.2 试验方法

3.2.1 基因组DNA 的分离与质量检测、纯化及浓度计算

3.2.2 DNA 池制备

3.2.3 生物信息学分析

3.2.4 牛MC4R 基因的引物设计及PCR 反应

3.2.5 PCR 扩增产物的回收纯化及测序

3.2.6 酶切反应

3.3 统计分析

3.4 结果与分析

3.4.1 牛MC4R 基因的生物信息学分析

3.4.2 PCR 扩增及测序结果

G 的Tai I 酶切结果'>3.4.3 MC4R 基因-129 位A>G 的Tai I 酶切结果

G 多态位点遗传分析'>3.4.4 MC4R 基因-129 A>G 多态位点遗传分析

G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>3.4.5 MC4R 基因-129A>G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

G 的Tai I 酶切结果'>3.4.6 MC4R 基因1069 C>G 的Tai I 酶切结果

G 多态位点遗传分析'>3.4.7 MC4R 基因1069 C>G 多态位点遗传分析

G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>3.4.8 MC4R 基因1069 C>G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

G 位点突变的生物信息学分析'>3.4.9 MC4R 基因1069 C>G 位点突变的生物信息学分析

3.5 讨论

3.5.1 SNPs 的筛查与鉴定

3.5.2 MC4R 基因多态性及性状的关联分析

3.5.3 MC4R 基因的生物信息学分析

3.6 小结

第四章牛APOA1 基因遗传变异及其与秦川牛经济性状的相关分析

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.2.1 基因组DNA 的分离与质量检测、纯化及浓度计算

4.2.2 生物信息学分析

4.2.3 牛 APOA1 基因的引物设计及 PCR 扩增

4.2.4 PCR 扩增产物的回收纯化及测序

4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳及酶切反应

4.3 统计分析

4.4 结果与分析

4.4.1 牛ApoA1 基因的生物信息学分析

4.4.2 PCR 扩增及测序

4.4.3 ApoA1 基因A11 引物扩增及SSCP 结果

4.4.4 ApoA1 基因A12 引物扩增、SSCP 及测序结果

G 多态位点遗传分析'>4.4.5 ApoA1 基因411 C>G 多态位点遗传分析

G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>4.4.6 ApoA1 基因411 C>G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

4.4.7 ApoA1 基因A13 引物扩增及突变位点寻找

G 的Msp A1 I 酶切结果'>4.4.8 ApoA1 基因1523 T>G 的Msp A1 I 酶切结果

G 多态位点遗传分析'>4.4.9 ApoA1 基因1523 T>G 多态位点遗传分析

G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>4.4.10 ApoA1 基因1523 T>G 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

A 的Dde I 酶切结果'>4.4.11 ApoA1 基因1572 C>A 的Dde I 酶切结果

A 多态位点遗传分析'>4.4.12 ApoA1 基因1572 C>A 多态位点遗传分析

A 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析'>4.4.13 ApoA1 基因1572 C>A 多态位点与秦川牛经济形状的关联分析

4.5 讨论

4.5.1 SNP 筛查方法

4.5.2 ApoA1 基因的多态性及性状关联分析

4.6 小结

第五章牛 APOA4 基因克隆及遗传变异分析

5.1 试验材料

5.1.1 组织样品

5.1.2 血样

5.2 试验方法

5.2.1 总RNA 的提取

5.2.2 总RNA 的纯化

5.2.3 总RNA 检测

5.2.4 ApoA4 基因cDNA 克隆的引物设计

5.2.5 PCR 反应

5.2.6 PCR 反应产物的回收及测序

5.2.7 ApoA4 基因的生物信息学分析

5.2.8 牛ApoA4 基因SNPs 筛查

5.3 结果与分析

5.3.1 组织中总RNA 的提取及检测

5.3.2 牛ApoA4 基因克隆

5.3.3 牛ApoA4 基因的同源性分析

5.3.4 牛 ApoA4 的疏水性分析

5.3.5 牛 ApoA4 的跨膜结构分析

5.3.6 牛 ApoA4 的信号肽预测

5.3.7 牛ApoA4 蛋白二级结构预测

5.3.8 牛ApoA4 蛋白三级结构预测

5.3.9 牛ApoA4 基因SNP 筛查

5.4 讨论

5.4.1 组织中RNA 的提取

5.4.2 ApoA4 基因的克隆

5.4.3 基因的生物信息学分析

5.5 小结

第六章总结

6.1 主要的研究结果

6.2 创新点

6.3 值得进一步研究的问题

参考文献

致谢

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