锯缘青蟹性别分化和性腺发育的EST及基因芯片初步分析

论文摘要

本研究采用SMART技术结合DSN处理,成功地构建了线性化cDNA文库三个,其中精巢和卵巢文库各一个,另一个为精巢、卵巢、眼柄、输精管、射精管和产雄腺混合的文库。经测定三个文库的滴度分别为4.8×105 cfu/mL, 3.1×106 cfu/mL, 5.3×106 cfu/mL,所有三个文库扩增后都含有1011以上重组子。各文库的插入cDNA长度均分布在0.5-3kb,经随机PCR检测,初步确定了三个文库重组率分别为93.7%、95.8%和100%。随机从文库中挑取6816个克隆（其中688个来自精巢文库,926个来自卵巢文库,5202个来自混合文库）进行EST（Expressed Sequence Taq）测序,共得到6116条ESTs,其中测长大于100bp的有5160条,测长短于100bp的有813条,其余为空载。经统计分析,5160条ESTs共代表了4136个基因,其中含有575个叠连群（Contigs）和3561条单基因（Singlets）,平均冗余率为19.84%,平均读长为348bp。经生物信息学分析,998个为已知基因占总ESTs的24.13%,已知基因聚类后被初步归为22类,其中有在生物学上与sry、sox、卵黄蛋白原、卵黄蛋白原受体、细胞周期蛋白、泛素、热休克蛋白家族、抗氧化酶系统等基因具有相关性的序列。在测序及生物信息学分析的基础上,结合相关软件（Redhat Linux 9.0、apache、PHP、MySQL、wwwBLAST）构建了本地化的序列查询数据库,实现了EST数据的本地比对查询管理等功能。以进行EST测序的6816单克隆为模板,去除冗余的克隆后进行大规模扩增,纯化后用自动机械手点印至氨基化玻璃片基上制成含5664（59×96）个斑点的cDNA芯片。分别取等量成熟的雌雄个体的性腺总RNA以随机6碱基寡核苷酸作为引物进行逆转录,合成参入了aa-dUTP的单链cDNA,随后分别标记上Cy3和Cy5染料制成荧光探针去杂交印制在芯片上的探针,经激光共聚扫描仪采集电子图谱后用基于线性模型的基因芯片分析软件LimmaGUI进行数据线性化处理和基因表达图谱的分析。荧光强度比值大于2和小于0.5的基因定义为上调基因和下调基因,结果显示本研究中有23个基因在精巢中为上调表达基因17个基因为卵巢特异表达基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 锯缘青蟹形态特征、自然分布和生活习性
• 1.2 本研究的目的意义
• 1.3 性别决定和分化暨性腺发育基因研究进展
• 1.4 cDNA 文库在功能基因筛选上的应用
• 1.5 表达序列标签应用概述
• 1.6 基因芯片在筛选差异表达基因上的应用
• 1.7 主要研究内容和技术路线
• 1.7.1 主要研究内容
• 1.7.2 本研究技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.4 主要应用软件与生物信息学网站
• 2.1.5 主要引物序列
• 2.2 方法
• 2.2.1 精巢卵巢总RNA 抽提及mRNA 分离
• 2.2.2 线性化 cDNA 文库构建
• 2.2.3 阳性克隆筛选
• 2.2.4 ESTs 大规模测序
• 2.2.5 芯片印制与杂交
• 第三章 结果
• 3.1 线性化文库构建
• 3.1.1 总RNA 抽提的结果
• 3.1.2 mRNA 分离
• 3.1.3 长距离PCR 合成双链cDNA
• 3.1.4 DSN 活性检测
• 3.1.5 最佳循环数确定
• 3.1.6 线性化处理双链cDNA
• 3.1.7 Sfi I 酶切双链cDNA
• 3.1.8 文库滴度测定
• 3.1.9 文库重组率计算
• 3.2 EST 测序及序列比对
• 3.2.1 克隆筛选
• 3.2.2 EST 测序结果
• 3.2.3 EST 电子数据库构建
• 3.3 基因芯片分析
• 第四章 讨论
• 4.1 RNA 质量
• 4.2 文库讨论
• 4.3 EST 测序结果分析
• 4.3.1 sry 与sox 基因功能
• 4.3.2 细胞周期相关基因
• 4.3.3 卵黄蛋白原和卵黄蛋白原受体基因
• 4.3.4 热休克蛋白家族
• 4.3.5 泛素系统
• 4.3.6 抗氧化防御系统
• 4.3.7 抗病相关基因
• 4.3.8 其他基因
• 4.4 EST 数据库构建
• 4.5 基因芯片分析
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的学术论文和研究成果