红肉脐橙（Citrus sinenesis Osbeck）果实生长发育过程中类胡萝卜素生物合成基因表达的原位检测

论文摘要

柑橘是富含类胡萝卜素的水果,大多情况下果皮含量多于果肉。近年来以柑橘红肉突变体为对象的研究引起了越来越广泛的关注,这些突变体一方面赋予本身优良的外观,另一方面为柑橘果实芽变发生的机理研究以及柑橘果肉中的类胡萝卜素生物合成的研究提供了理想的材料。本研究以红肉脐橙(C.sinensis Osbeckcv ’Cara Cara’)和清家脐橙(C.sinensis Osbeck cv ’Seika’)为实验材料,利用RNA原位杂交技术分析了果实不同组织中类胡萝卜素生物合成相关基因的表达。主要研究结果如下:1.通过对汁胞进行徒手切片和压片的显微观察,在红肉脐橙汁胞中检测到了红色线状有色体的存在。在番茄和红色葡萄柚中发现了类似的情形,随着果实发育的进行这种形状的有色体在红肉脐橙汁胞中有积累的趋势。2.将不同发育时期的红肉脐橙和清家脐橙果实样品制成石蜡切片,利用特异性的cRNA探针进行原位杂交,结果表明:psy、pds、lcyb在红肉脐橙和清家脐橙黄皮层中均有表达;mRNA多积累在接近皮层的表层细胞内,在油胞及其周边组织细胞中未能检测到mRNA的积累;不同果实发育期mRNA的积累存在差异;白皮层和汁胞中相应的mRNA分布没有黄皮层组织中明显,但是可看出白皮层和汁胞中psy、pds、lcyb的表达量低于黄皮层组织中的表达量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目标及内容
• 2 文献综述
• 2.1 柑橘类胡萝卜素生物合成研究进展
• 2.1.1 柑橘类胡萝卜素组成及含量
• 2.1.2 柑橘类胡萝卜素合成相关基因的研究进展
• 2.1.3 柑橘类胡萝卜素生物合成途径的调控
• 2.2 植物基因表达研究方法
• 2.2.1 Northern杂交
• 2.2.2 RNA原位杂交
• 2.2.3 反转录PCR技术
• 2.2.4 实时荧光定量PCR技术
• 3 材料与方法
• 3.1 材料准备
• 3.2 仪器设备
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 红肉脐橙和清家脐橙汁胞观察
• 3.3.2 RNA原位杂交探针制备
• 3.3.3 石蜡切片
• 3.3.4 原位杂交
• 4 结果与分析
• 4.1 红肉脐橙汁胞中的特征表型
• 4.2 原位杂交探针制备
• 4.2.1 RNA提取
• 4.2.2 目的基因的克隆、表达载体的构建
• 4.2.3 质粒DNA的酶切线性化及体外转录
• 4.2.4 点杂交检测体外转录探针标记效率
• 4.3 原位杂交检测结果
• 4.3.1 红肉脐橙和清家脐橙黄皮层中原位杂交结果
• 4.3.2 红肉脐橙和清家脐橙白皮层中原位杂交结果
• 4.3.3 红肉脐橙和清家脐橙囊衣中原位杂交结果
• 4.3.4 红肉脐橙和清家脐橙汁胞中原位杂交结果
• 4.3.5 不同发育时期红肉脐橙psy基因的表达
• 5 讨论
• 5.1 采样时期和果实分割的依据
• 5.2 影响原位杂交试验成功与否的几个因素
• 5.3 红肉脐橙中原位杂交检测结果所反映出的类胡萝卜素生物合成基因的表达规律
• 5.4 柑橘汁胞中类胡萝卜素的积累与有色体的形成
• 参考文献
• 附录 1 红肉脐橙和清家脐橙不同发育时期果实图片
• 附录 2 RNA原位杂交用试剂
• 在读期间发表论文
• 致谢