论文摘要
第一部分仿去上皮羊膜微纳结构壳聚糖改性胶原透明质酸复合电纺膜的研制目的：利用高压静电纺丝与静电吸附表面改性技术探讨制备仿去上皮人羊膜超微结构壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜的可行性,获得胶原以乙酸为溶剂制备纳米纤维以及在聚环氧乙烷为促电纺剂下胶原复合透明质酸制备纳米纤维的最佳浓度配比,在此基础上联合交联和静电吸附表面改性技术优化复合电纺膜的稳定性与表面微纳结构,以期为眼表损伤修复用覆膜的研究提供实验基础,拓宽静电纺丝纳米技术和静电吸附表面改性技术在生物医学领域的应用范围。方法：首先对人羊膜组织微观形貌进行细致观察分析,在此基础上,采用具有良好生物相容性的天然高分子材料胶原、透明质酸和人工合成高分子材料聚环氧乙烷为主要的研究原料,通过对电纺原材料浓度配比的调整,优化静电纺丝各项参数,制备复合电纺薄膜。通过戊二醛交联和透明质酸与壳聚糖静电吸附作用,改善电纺薄膜的稳定性和微纳结构,肉眼观察评估所制备的复合电纺膜的透明性和可操作性,扫描电镜检测薄膜表面和断面微结构,分析评价壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜与去上皮人羊膜组织在微观形貌上的相似性。结果：去上皮人羊膜基底膜和基质是由平均直径分别为52.9±17.5nm和41.2±14.7nm的胶原纤维无规则排列组成的片层结构。在25℃,40%湿度环境中,推进速度为0.1ml/h,接收距离为10cm,电压在10-15KV之间时,电纺处于稳定状态。10%w/v胶原以90%v/v乙酸为溶剂电纺可以制备平均直径为79.1±27.8nm的纤维薄膜；10%w/vCOL、0.1%w/vHA和7%w/vPEO以8：1：1体积比电纺可以制备平均直径为106.6±40.9nm,表面光滑,具有良好分散性的纳米纤维薄膜。戊二醛交联不仅使复合电纺膜纳米纤维形态和直径（平均直径为66.3±24.8nm）更接近于羊膜基底膜和基质,而且大大改善了薄膜的透明性和可操作性；在不影响复合膜纤维形态和直径前提下复合膜实现壳聚糖表面改性并与去上皮人羊膜微观形貌更加相近。结论：本研究首先证实了胶原、透明质酸复合聚环氧乙烷电纺制备具有纳米级直径均一纤维薄膜的可行性；并在此基础上,通过戊二醛交联和静电吸附表面改性方法对复合薄膜透明性和可操作性进行优化,实现了对去上皮人羊膜组织微纳结构的人工模拟,为临床眼表损伤修复用眼表覆膜的研究和应用奠定了可靠的实验基础。第二部分仿去上皮羊膜微纳结构壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜的物理化学性能研究目的：对胶原-透明质酸复合电纺膜、交联膜和壳聚糖改性膜的物理化学性能进行表征,探讨交联和表面改性后处理对薄膜理化性能的影响,对比分析壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜与去上皮人羊膜组织相应性能的差异,为进一步优化该类眼表修复覆膜研究奠定实验基础,同时也为临床上眼表组织修复支架的制备提供新的方法和研究思路。方法：采用紫外-可见光光度仪对不同薄膜的可见光透过率进行检测,傅里叶转换红外线光谱分析不同薄膜的化学组成及变化,万能测试机对薄膜的抗拉强度、杨氏模量和最大伸长率进行测试分析,静态水接触角对不用薄膜的亲疏水性进行分析比较。结果：干燥状态下,在555nm波长处交联膜和壳聚糖表面改性膜的可见光透过率分别为70%和75%,而羊膜仅为40%；在湿润状态下,在555nm波长处交联膜和壳聚糖表面改性膜的可见光透过率分别增加到88%和89%,羊膜在该处的可见光透过率增加到74%。胶原-透明质酸复合电纺膜、交联膜和壳聚糖改性膜的红外光谱图中均存在胶原、透明质酸特征性吸收峰,但交联膜和壳聚糖改性膜在2000-1000cm-1附近的吸收峰强度降低,位于3314cm-1、1619cm-1和1430cm-1附近的吸收峰信号变弱；壳聚糖改性膜中酰胺A,酰胺Ⅰ,Ⅱ键吸收峰波幅较交联膜增强；在交联膜和壳聚糖改性膜中,均未检测到聚环氧乙烷特征性吸收峰；在壳聚糖改性膜中检测到所有壳聚糖特征性吸收峰；壳聚糖改性膜与去上皮人羊膜相比均具有胶原、透明质酸特征性吸收峰,但壳聚糖改性膜在1750-1000cm-1范围内的吸收峰波幅较去上皮人羊膜者低。壳聚糖改性膜的平均抗拉强度为31.39±6.61Mpa,略低于去上皮人羊膜（39.72±4.43Mpa）,而在同等强度外力作用时,形变量为交联膜>壳聚糖改性膜>去上皮人羊膜。交联膜和壳聚糖改性膜的平均水接触角分别为18.6±1.70和23.9±2.60,均小于去上皮人羊膜（63.4±3.30）。结论：胶原-透明质酸交联膜和壳聚糖改性膜具有优于去上皮人羊膜组织的良好透明性；经电纺、交联和壳聚糖表面改性三步法处理后胶原和透明质酸仍保持原有活性不变；壳聚糖改性膜具有与去上皮人羊膜相似的化学组成；虽然复合膜的抗拉强度稍逊于去上皮人羊膜组织,但其更好的弹性和更高的亲水性对于我们后续细胞和组织相容性研究奠定了有利的理论基础。第三部分仿去上皮羊膜微纳结构壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜生物相容性研究目的：分析评价壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜的生物相容性,为仿羊膜微纳结构眼表覆膜的临床应用和产业化提供理论依据和实验基础,从根本上推进眼表修复用仿生人工薄膜材料的研制。方法：以去上皮人羊膜为对照,采用体外细胞培养法将人角膜上皮、结膜上皮细胞接种于壳聚糖改性膜上,扫描电镜观察细胞的粘附形态,活死细胞染色检测薄膜对细胞的毒性作用,CCK-8法比较细胞在薄膜表面的增殖能力；构建大鼠角膜急性碱烧伤模型,荧光素钠和苏木精-伊红染色观察壳聚糖改性膜移植后角膜上皮再生水平,肉眼观察基质水肿和炎症反应情况,评价薄膜的可操作性和在体生物相容性。结果：角膜上皮细胞在壳聚糖改性膜上具有类似于正常角膜上皮的无规则扁平样外观,结膜上皮细胞在该膜上表现出细胞与材料相互融合现象；接种24h后在壳聚糖改性膜上角膜上皮细胞可检测到极少量的细胞死亡而结膜上皮细胞未检测到细胞死亡；细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强,差异有统计学意义（p<0.05）,而同种细胞在不同薄膜上的增殖能力无明显差异（p=1.12）；壳聚糖改性膜在大鼠急性碱烧伤角膜表面保持良好的透明性,与基质面贴合紧密；薄膜下可见角膜上皮再生并与其下基质粘连紧密,角膜基质水肿和炎症反应均减轻。结论：壳聚糖改性胶原-透明质酸复合电纺膜具有良好的细胞相容性,在动物角膜急性碱烧伤模型中表现出良好的可操作性和透明性,具有与去上皮人羊膜组织相似的促上皮化、抑制基质水肿和炎症反应特性,本研究结果为探寻仿羊膜结构与功能材料的研制进而为眼表修复用仿生薄膜材料的研究奠定了扎实的实验基础,为临床上眼表疾病的治疗提供了一条新的途径。
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