重组牛干扰素τ抗马传染性贫血病毒效果的研究

论文摘要

干扰素（interferon, IFN）是由动物细胞产生并释放的一种具有高度生物活性、多种生物学功能的蛋白质,特别是在抵御感染、抗细胞增殖以及免疫调节方面具有重要的作用。目前已经有IFN类生物制品在临床上应用。IFN-τ是一种独特的IFN,属于I类IFN。最初发现IFN-τ是反刍动物妊娠过程中比较重要的细胞因子,除与动物维持妊娠有关外,近年来也证实了它的免疫学功能,特别是有显著抗慢病毒增殖效果。与其他IFN相比,IFN-τ具有抗病毒效果好、细胞毒性低和副作用小甚至无毒副作用等特点。IFN-τ在临床应用上的潜力已经引起科研工作者的注意。近年来,越来越多的实验室开展了针对IFN-τ抗病毒效果和免疫调节功能的研究,并且已经开始进行IFN-τ跨种间抗病毒效果及免疫功能的研究。值得注意的是,鉴于IFN-τ有显著抗慢病毒增殖的特点,已经开始设想用IFN-τ对人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV ）感染者进行治疗。马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus,EIAV）作为逆转录病毒亚科慢病毒属中基因结构最简单的成员,是目前公认最理想的慢病毒研究模型。由于EIAV和HIV在病毒形态、基因组结构、细胞嗜性、免疫机制及病毒与宿主相互作用等方面都十分相似,深入研究EIAV感染与免疫机制,能够为HIV的相关研究提供借鉴,因此EIAV的感染与免疫机制的研究已受到国内外学者的高度重视。本研究选择EIAV作为靶病毒,尝试研究和评价重组牛干扰素τ（recombinant bovine interferon tau, rBoIFN-τ）的抗慢病毒效果,并与重组马干扰素（γrecombinant equine interferon gamma, rEIFN-γ）在抗病毒增殖、干扰素刺激基因（Interferon Stimulate Gene, ISG）节点因子介导水平等方面进行比较,分析IFN-τ与IFN-γ抗EIAV病毒的效果上的差异,进而揭示两者的免疫调节机理。本研究采用VSV-MDBK结晶紫染色法分别对rEIFN-γ和rBoIFN-τ进行滴定,并采用Cell Counting Kit-8对两种IFN在ED-EIAV上的细胞毒性进行检测和比较,然后在不产生细胞毒性的条件下,应用逆转录酶活性检测法和real-Time PCR检测和评价两种IFN在ED-EIAV细胞上的抗病毒效果。在上述研究的基础上,用Real-Time PCR检测经过两种IFN处理后不同时间点的ED-EIAV细胞中EIF2AK2、OAS1和Mx protein三种因子基因表达情况,并通过结合比较两种IFN处理后ISG基因的表达情况,探讨两种IFN抗病毒作用机理。本研究证明,尽管其抗病毒效果低于rEIFN-γ,rBoIFN-τ在ED-EIAV细胞上确实表现出了一定的抗EIAV病毒的效果,大约10倍量的rBoIFN-τ抗EIAV效果与rEIFN-γ相当,但是其细胞毒性明显低于rEIFN-γ。另外,同rEIFN-γ一样,rBoIFN-τ也能刺激三种节点ISG基因的表达,而且表达上调的趋势也具有相似性,但rBoIFN-τ诱导这三种因子表达的能力显著低于rEIFN-γ,特别是在诱导OAS1基因和Mx protein基因表达的能力上两者差异更为显著。由此推测,IFN-τ的抗病毒机制可能与IFN-γ以及其他IFN的抗病毒机制不同,除了EIF2AK2、OAS1和Mx protein三种因子为代表的通路之外,很可能还存在其它的抗病毒通路,并且这一机制上的差异也可能与IFN-τ细胞毒性低有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 IFN 的研究进展
• 1.1.1 IFN 的渊源
• 1.1.2 IFN 的作用机制
• 1.1.3 rEIFN-γ 与 rBoIFN-τ 特性
• 1.2 EIF2AK2、OAS 和Mx protein 三种因子的特性
• 1.2.1 EIF2AK2 的特性
• 1.2.2 OAS 的特性
• 1.2.3 Mx protein 的特性
• 1.3 内参基因简介
• 1.3.1 内参基因的种类
• 1.3.2 内参基因GAPDH 简介
• 1.3.3 内参基因β-actin 简介
• 1.4 EIA 的研究进展
• 1.4.1 EIA 概述
• 1.4.2 EIAV 及其分子生物学
• 1.4.3 EIA 的流行病学
• 1.4.4 EIA 的病理生理学特点
• 1.4.5 EIA 的防治
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 rBoIFN-τ与rEIFN-γ抗病毒效果研究
• 2.1 rBoIFN-τ和rEIFN-γ的滴定
• 2.1.1 材料和方法
• 2.1.1.1 材料
• 2.1.1.2 方法
• 2.1.2 结果
• 2.1.2.1 rBoIFN-τ滴度的测定
• 2.1.2.2 rEIFN-γ滴度的测定
• 2.2 rBoIFN-τ和rEIFN-γ在ED-EIAV 细胞上的细胞毒性检验
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 材料
• 2.2.1.2 方法
• 2.2.2 结果
• 2.2.2.1 rBoIFN-τ和在ED-EIAV 上的细胞毒性
• 2.2.2.2 rEIFN-γ在ED-EIAV 细胞上的毒性
• 2.3 rEIFN-γ和rBoIFN-τ处理ED-EIAV 细胞后逆转录酶含量的检测
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 材料
• 2.3.1.2 方法
• 2.3.2 结果
• 2.3.2.1 rBoIFN-τ处理组ED-EIAV 细胞上清中逆转录酶含量的检测
• 2.3.2.2 rEIFN-γ处理组ED-EIAV 细胞上清中逆转录酶的检测
• 2.4 rEIFN-γ和rBoIFN-τ处理后EIAV 病毒RNA 的检测
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.1.1 材料
• 2.4.1.2 方法
• 2.4.1.2.1 细胞培养上清中病毒RNA 的提取
• 2.4.1.2.2 细胞总RNA 的提取
• 2.4.1.2.3 一步法绝对实时荧光定量PCR 检测方法
• 2.4.1.2.4 统计方法
• 2.4.2 结果
• 2.4.2.1 rEIFN-γ处理后ED-EIAV 细胞上清中病毒基因拷贝数的检测
• 2.4.2.2 rEIFN-γ处理后ED-EIAV 细胞中病毒基因拷贝数的检测
• 2.4.2.3 rBoIFN-τ处理ED-EIAV 细胞后细胞上清中病毒基因拷贝数的检测
• 2.4.2.4 rBoIFN-τ处理后ED-EIAV 细胞中病毒基因拷贝数的检测
• 2.5 rEIFN-γ和rBoIFN-τ处理后相关因子mRNA 拷贝数的检测
• 2.5.1 材料与方法
• 2.5.1.1 材料
• 2.5.1.2 方法
• 2.5.1.2.1 细胞总RNA 的提取
• 2.5.1.2.2 一步法荧光定量RT-PCR 方法对IFN 相关因子的检测
• 2.5.2 结果
• 2.5.2.1 rEIFN-γ处理ED-EIAV 细胞后三种相关因子基因拷贝数的检测
• 2.5.2.2 rBoIFN-τ处理ED-EIAV 细胞后三种相关因子基因拷贝数的检测
• 2.6 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历