产几丁质酶重组枯草芽孢杆菌的构建

论文摘要

几丁质及其衍生物经几丁质酶降解,产生一些几丁寡糖,能止血抗凝、抗肿瘤转移、降低血压,促进有益微生物（如双歧杆菌）生长;还能激活巨嗜细胞,诱导细胞因子产生,提高机体免疫力;另能刺激成纤维细胞增殖,有利于胶原沉积,与细胞外基质成分结合,促进组织修复。此外,几丁寡糖还有抗菌防腐、保水保湿等功效。在医药、化妆品等行业具有广泛的开发前景。本研究的目的是探索利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统来表达来自于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因。本文通过PCR的方法从苏云金芽孢杆菌的染色体上扩增得到几丁质酶基因chiA,通过测序鉴定与报道的苏云金芽孢杆菌konkukian亚种的几丁质酶基因的序列完全一致。分别构建表达载体pET-28a-chiA和pHSG-chiA,将它们分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达。通过酶活的测定在两种重组菌中都检测到了酶活。同时对重组芽孢杆菌所产的重组酶的酶学性质作了初步的研究。重组酶的最适作用温度大约在50℃,30℃-60℃为酶的稳定温度范围,同时将酶60℃保温30 min,仍然保持约80%的酶活力。最适作用pH约7.0,酶的稳定pH范围为4-8。考察发现pET-28a-chiA在大肠杆菌中稳定性较好,而对于芽孢杆菌表达载体pHSG-chiA在传代过程中发生质粒丢失的现象,无选择压力下连续转接5次,几乎全部发生丢失。对重组菌的发酵条件进行了初步的优化,分别考察了碳源、氮源、培养基初始pH、装液量、接种量以及诱导时机对产酶的影响。得到了最终的优化培养基,其成分为:几丁质2%,酵母膏2.5%, NaCl 1%, K2HPO4 0.1%, MgSO4·7H2O 0.01% ,调节初始pH为8.0,装液量为250 mL摇瓶加入培养基20 mL培养基,接种量10%,诱导时机选择在培养4 h后,加入IPTG诱导,继续培养8 h测定酶活。通过优化后酶活可以提高到4.8 U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 几丁质酶的应用
• 1.2.1 几丁质酶在抗病基因工程中的应用
• 1.2.2 几丁质酶在生物防治中的应用
• 1.2.3 几丁质酶降解几丁质的产物的应用
• 1.3 几丁质酶的研究进展
• 1.3.1 几丁质酶的研究历史和现状
• 1.3.2 微生物几丁质酶的分子生物学特性
• 1.3.3 微生物几丁质酶的克隆和表达研究
• 1.4 枯草芽孢杆菌体系研究进展
• 1.5 本研究的立题意义和研究内容
• 1.5.1 立题意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 工具酶和试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 分子克隆技术
• 2.1.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析
• 2.1.7 酶活力测定
• 2.1.8 重组质粒的稳定性分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）几丁质酶基因的克隆
• 2.2.2 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.3 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 结果分析
• 2.2.4 酶活力的测定
• 2.2.5 重组质粒稳定性分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及重组酶酶学性质初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 工具酶和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 分子克隆技术
• 3.1.6 酶活测定
• 3.1.7 重组酶酶学性质初步研究
• 3.1.8 重组质粒稳定性分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 重组质粒pHSG-chiA 的构建
• 3.2.2 重组菌酶活的测定
• 3.2.3 重组酶的酶学性质的测定
• 3.2.4 重组质粒稳定性分析
• 3.3 本章小结
• 第四章 重组芽孢杆菌的培养基及发酵条件初步优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 酶活测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 碳源对产酶的影响
• 4.2.2 氮源对产酶的影响
• 4.2.3 培养基初始pH 对产酶的影响
• 4.2.4 装液量对产酶的影响
• 4.2.5 接种量对产酶的影响
• 4.2.6 诱导时机对产酶的影响
• 4.2.7 优化培养条件下重组菌产酶情况的考察
• 4.3 本章小结
• 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文