肾上腺髓质素介导运动预适应心肌细胞保护作用及其机制的研究

论文摘要

研究目的:反复短暂的心肌缺血/再灌注可使心肌在随后持续性缺血中得到保护的现象,称为缺血预适应（ischemic prenconditioning,IP）,IP是心肌的一种内源性保护机制。多次短暂的大强度运动诱导心肌相对缺血/再灌注也可对心肌产生IP样的保护作用,称为运动预适应（exercixe prenconditioning,EP）,EP是IP的一种特殊形式。研究表明,IP和EP的保护作用都与诱导内源性保护物质的产生有关。肾上腺髓质素（Adrenomedullin,ADM）是新发现的重要的心脏内源性保护物质,心脏产生这种物质;ADM对心脏的直接保护作用;特异性阻滞剂可阻断ADM的保护作用;外源性给予ADM可产生心脏保护作用;运动可诱导ADM的产生和释放。EP是有效的心脏保护措施,ADM是重要的心脏内源性保护物质,运动可诱导ADM的产生,EP的心脏保护作用是否是通过ADM,其保护作用的机制是什么,长期和短期EP的保护效果及其机制有什么不同,目前国内外还没有报道。因此,本研究在建立短期和长期EP模型的基础上,探讨ADM介导EP心脏保护作用及其机制,为EP心脏保护作用及其机制的研究提供新的理论和实验依据。研究方法:本研究采用雄性SD大鼠90只,随机分为对照组（C组）,异丙肾上腺素组（isoprenaline,ISO组）,3天（短期）运动预适应组（3dEP组）,3周（长期）运动预适应组（3wEP组）,3天运动预适应+异丙肾上腺素组（3dEP+ISO组）,3周运动预适应+异丙肾上腺素组（3wEP+ISO组）。3dEP组、3dEP+ISO组和3wEP组、3wEP+ISO组分别进行连续3天和3周的间歇跑台训练建立3天和3周EP动物模型。在最后一次运动结束后30min,3dEP+ISO组和3wEP+ISO组通过腹腔注射大剂量ISO,ISO组同时腹腔注射等量ISO,复制大鼠心肌缺血损伤模型。采用免疫化学发光法检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的含量;用HE染色法观察心肌组织形态结构改变;用苏木素碱性复红苦味酸染色法（haematoxylin basie fuchsin picric,HBFP染色）观察心肌缺血缺氧改变;用透射电镜观察心肌细胞超微结构改变;用酶联免疫法检测血清和心肌ADM的含量;应用原位杂交技术显示心肌细胞ADM mRNA的定位表达;用免疫组织化学法显示心肌、冠状血管ADM的分布与表达;用计算机图像分析技术对心肌细胞的ADM mRNA,心肌组织、冠状血管ADM进行定量分析。研究结果:（1）ISO组血清cTnI含量明显高于C组（p<0.05）;3dEP组和3wEP组血清cTnI含量与C组相比,差异均不具有显著性;3dEP+ISO组血清cTnI含量明显高于C组（p<0.05）,但明显低于ISO组（p<0.05）;3wEP+ISO组血清cTnI含量与C组相比,差异不具有显著性,但明显低于ISO组（p<0.05）。（2）C组、3dEP组和3wEP组心肌纤维形态结构正常,无红色缺血缺氧改变;ISO组心肌纤维有大量的片状红色缺血缺氧改变;3dEP+ISO组和3wEP+ISO组心肌纤维有少量点状红色缺血缺氧改变。（3）与C组比较,3dEP组和3wEP组血清ADM含量无显著变化。（4）C组、3dEP组和3wEP组心肌细胞超微结构正常;ISO组心肌细胞超微结构出现严重损伤;3dEP+ISO组和3wEP+ISO组心肌细胞超微结构损伤明显没有ISO组严重。（5）C组心肌细胞中ADM mRNA的原位杂交信号位于胞浆内,呈棕黄色。3dEP组原位杂交信号与C组相比没有明显差异;3wEP组原位杂交信号强于C组。计算机图像分析表明,3wEP组ADM mRNA原位杂交信号的阳性表达面积和平均光密度明显高于C组（p<0.05）。C组冠状血管中ADM mRNA的原位杂交信号位于冠状血管壁内,呈棕黑色。3dEP组原位杂交信号与C组相比没有明显差异;3wEP组原位杂交信号弱于C组。计算机图像分析表明,3wEP组ADM mRNA原位杂交信号的阳性表达面积和平均光密度明显低于C组（p<0.05）。（6）C组心肌ADM免疫反应阳性呈棕褐色,在心肌胞浆中呈低强度分布,在冠状血管呈高强度分布。计算机图像分析表明,3wEP组ADM在心肌阳性表达面积和平均光密度明显高于3dEP组和C组（p<0.05）,在冠状血管ADM阳性表达面积和平均光密度明显明显低于3dEP组和C组（p<0.05）。（7）3dEP组心肌ADM含量与C组相比,差异不具有显著性;3wEP组心肌ADM含量明显高于C组（p<0.05）。研究结论:（1）用连续3d和3w间歇运动诱导IP效应的方法可以建立短期和长期EP动物模型。血清cTnI含量、心肌组织缺血缺氧改变和心肌细胞超微结构改变,显示了EP的心肌细胞保护作用。（2）长期EP使心肌细胞ADM mRNA表达增加,表明长期EP促进了ADM在心肌的合成,即其调节可能主要在转录水平。（3）长期EP使心肌ADM总的含量增加,其中心肌细胞ADM蛋白表达增加,而冠状血管内皮细胞和平滑肌细胞ADM蛋白表达减少,血清ADM含量未发生变化,提示长期EP引起的相对缺氧和心肌收缩能力增强可能引起心肌ADM的表达增加,心肌细胞与冠状血管内皮细胞和平滑肌细胞分泌的ADM,通过自分泌和旁分泌的方式发挥作用。（4）长期EP使心肌组织ADM增加,其维持心肌局部血流动力学的稳定及其抗氧化作用可能是长期EP对ISO致心肌损伤的保护机制之一。（5）短期EP没有使心肌ADM发生改变,ADM与短期运动预适应之间的关系还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 2 研究总体设计和技术路线
• 第一部分 运动预适应的心肌细胞保护作用与肾上腺髓质素研究进展
• 1 运动预适应的心肌细胞保护作用
• 1.1 细胞保护概述
• 1.2 缺血预适应与心肌细胞保护
• 1.3 运动预适应与心肌细胞保护
• 1.4 运动预适应研究中存在的问题和展望
• 2 肾上腺髓质素的研究进展
• 2.1 肾上腺髓质素的基因结构与表达调控
• 2.2 肾上腺髓质素的基因表达
• 2.3 肾上腺髓质素的来源
• 2.4 肾上腺髓质素受体
• 2.5 肾上腺髓质素的信号转导过程
• 2.6 肾上腺髓质素的生物学作用
• 2.7 肾上腺髓质素与运动
• 3 运动预适应与肾上腺髓质素
• 4 参考文献
• 第二部分 运动预适应诱导心肌细胞保护作用的研究
• 1 前言
• 2 实验对象与方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验仪器与试剂
• 2.3 动物分组
• 2.4 运动预适应动物模型的建立
• 2.5 ISO 大鼠心肌缺血性损伤模型的制作
• 2.6 取材
• 2.7 实验方法
• 2.8 统计方法
• 3 实验结果
• 3.1 建模过程中大鼠状态的变化
• 3.2 建模过程中大鼠饮食量及体重的变化
• 3.3 大鼠血清 cTnI 的变化
• 3.4 大鼠心肌HE 染色变化
• 3.5 大鼠心肌HBFP 染色变化及计算机图像分析结果
• 3.6 大鼠心肌细胞超微结构的变化
• 4 分析与讨论
• 4.1 运动预适应动物模型的建立
• 4.2 运动预适应诱导的心肌细胞保护作用
• 5 结论
• 6 参考文献
• 第三部分 肾上腺髓质素介导运动预适应心肌细胞保护作用机制的研究
• 1 前言
• 2 实验对象与方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验仪器与试剂
• 2.3 动物分组
• 2.4 动物模型的建立
• 2.5 实验方法
• 2.6 统计方法
• 3 结果
• 3.1 大鼠血清ADM 含量的变化
• 3.2 心肌组织 ADM 含量的变化
• 3.3 心肌 ADM mRNA 表达的变化与计算机图像分析
• 3.4 心肌 ADM 免疫反应产物分布和表达的变化与计算机图像分析
• 4 讨论与分析
• 4.1 运动预适应对大鼠心肌细胞ADM m RNA 表达的影响
• 4.2 运动预适应对大鼠肾上腺髓质素的影响
• 4.3 肾上腺髓质素在运动预适应心肌细胞保护中的作用和机制
• 5 结论
• 6 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 在读期间科研工作和发表论文情况
• 英文缩略词表