大鼠脂肪源性干细胞与成纤维细胞间接共培养的实验研究

论文摘要

【研究背景】女性盆底功能障碍性疾病（pelvic floor dysfunction,PFD）是指盆底支持结构缺陷、损伤及功能障碍造成的疾患,主要包括压力性尿失禁（stress urinary incontinence,SUI）、盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse,POP）、性功能障碍和粪失禁。据统计在美国社区妇女中,约23.7%的妇女存在一种以上的PFD,并且随着年龄的增长患病率增加。人口老龄化也加重了PFD的疾病负担,2005-2006年用于治疗PFD的经济费用较1996-1997年增加约1倍。因此,认为PFD是严重影响女性的生活质量、身心健康以及增加人们负担的慢性疾病之一。手术治疗是PFD治疗的常用方法,女性在80岁前因POP或SUI而需行吊带手术治疗的几率为11.1%。现代的手术理念是利用补片使盆腔脏器达到解剖和功能的恢复,补片包括人工合成补片,生物补片。单股、大网孔的聚丙烯补片被认为是治疗PFD的最好的合成材料,但是其仍然存在一定的手术并发症,包括补片外露、侵蚀、补片皱缩,而因补片引起的疼痛和性交困难的发生率更高,高达17%。生物补片由于具有良好的生物相容性,与合成补片相比,与补片相关的并发症发生率明显降低,但是术后补片的降解问题一直是生物补片临床应用的难题。胶原蛋白是韧带和筋膜等支持结构的主要组成部分,对维持盆底支持组织的弹性和韧性起重要作用。多项研究表明,女性盆底韧带筋膜成纤维细胞以及细胞基质中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量降低,提示成纤维细胞量的减少以及胶原蛋白含量降低是PFD可能的致病机理。2003年Lee等用肌源性干细胞治疗大鼠压力性尿失禁,2010年Yamamoto等报道了2例利用自体脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）治疗前列腺根治术后尿失禁患者,均显示了良好的效果,提示利用干细胞治疗PFD的可能性。Park等发现ADSCs能有效促进胶原的合成,以及促进成纤维细胞向损伤组织迁移。那么如何促使ADSCs向成纤维细胞方向分化并分泌更多的胶原蛋白呢?有文献报道,干细胞通过与特定的组织细胞共培养可以促使干细胞向特定的方向分化。因此,本实验拟通过ADSCs与鼠胚成纤维细胞共培养,探讨ADSCs和成纤维细胞合成及分泌胶原蛋白的能力,为ADSCs作为PFD生物治疗的种子细胞提供实验依据。【目的】1探讨ADSCs的分离培养的实验方法,研究其细胞表面标记物的生物学特性,观察其向成脂、成软骨方向多向分化的潜能,为ADSCs实验方法学研究提供实验数据。2采用ADSCs与鼠胚成纤维细胞间接共培养的方法,探讨ADSCs和成纤维细胞在促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白合成中的相互作用,为ADSCs应用于盆底功能障碍性疾病的治疗提供组织工程学的实验依据。【方法】1从SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离、培养ADSCs,采用MTT（四甲基偶氮唑蓝）法进行细胞生长测定,并采用流式细胞仪检测细胞周期。2采用流式细胞仪检测ADSCs细胞表面标记物:CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105以及CD106。3应用成脂肪诱导因子（地塞米松、胰岛素、1-甲基-3-异丙基-黄嘌呤和吲哚美辛）和成软骨诱导因子（TGF-β1、胰岛素、转铁蛋白和维生素C）诱导ADSCs向成脂、成软骨方向分化。4取经鉴定的ADSCs和鼠胚成纤维细胞间接共培养,实验组上层为成纤维细胞,下层为ADSCs;对照组（1）:上下层均为ADSCs;对照组（2）:上下层均为成纤维细胞。每组6个重复孔,以105/孔细胞数接种6孔板,半定量RT-PCR检测不同时间点各组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达。5采用ELISA检测不同时间点各组的细胞培养上清液Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的含量。【结果】1体外培养的ADSCs增殖迅速,呈成纤维细胞样生长,细胞呈多角形、长梭形,形态均一;第1、3、5代细胞生长曲线呈“S”型;细胞周期结果显示G0/G1期细胞占90.6%。2体外培养的ADSCs表面抗原阳性表达率分别为:CD44 99.88%,CD105 95%, CD90 99.74%,CD49d 89.56%,CD34 3.04%,CD106 0.85%,CD45 0.26%;3体外培养的ADSCs成脂诱导后,诱导3天后细胞胞浆内出现脂滴,并不断的增加、变大融合,诱导7天后部分细胞胞浆被脂滴完全充满,诱导14天后油红“O”染色呈橘红色。4体外培养的ADSCs成软骨诱导后,细胞团形成稳定,诱导14天后,细胞团直径增大至2mm,表面光滑,阿利新蓝染色阳性。5半定量RT-PCR检测间接共培养细胞胶原蛋白mRNA表达结果:实验组下层ADSCsⅠ型胶原蛋白表达在共培养6天时较对照组（1）下层ADSCs明显增高,差异有统计学意义;而Ⅲ型胶原蛋白的表达则在共培养6天和9天时较对照组（1）高,差异有统计学意义。实验组上层成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达在共培养3天、6天和9天均较对照组（2）上层成纤维细胞高,差异具有统计学意义。6 ELISA检测共培养细胞上清液结果显示:间接共培养三组间的细胞培养上清液Ⅰ型胶原蛋白含量在6天和9天时有差异,差异具有显著性,其中实验组和对照组（2）的含量要高于对照组（1）,差异有统计学意义,而实验组与对照组（2）差异无统计学意义;而Ⅲ型胶原蛋白含量在培养3天和6天时有差异,差异有统计学意义,其中实验组和对照组（2）的含量要高于对照组（1）,差异有统计学意义,而实验组与对照组（2）差异无统计学意义。【结论】1本实验成功分离培养了ADSCs,其细胞表面标记符合ADSCs的特点。ADSCs能向成脂和成软骨分化,说明它具有多向分化的潜能.,可作为盆底缺陷生物工程学中的重要种子细胞。2 ADSCs与鼠胚成纤维细胞共培养后,通过细胞间的分泌相互影响,上调Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的基因表达,促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白分泌。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 大鼠ADSCs 的分离、培养及多向分化潜能研究
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 第二部分 大鼠ADSCs 与成纤维细胞共培养的相互作用
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 全文结论
• 本研究的局限性与展望
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢