论文摘要
脊髓空洞症（Syringomyelia，SM）是一种常见的退行性疾病，起病隐匿、进展缓慢，临床表现为受累脊髓节段不同程度的分离性感觉障碍、下运动神经元功能障碍、长传导束功能障碍和营养障碍。重者常因顽固性疼痛、肢体活动障碍而丧失工作能力或生活不能自理。本病病因尚未完全明了，且药物治疗无明显疗效，后颅窝减压和／或空洞引流术虽对某些病例症状有所缓解，但远期疗效不明确，故其治疗颇为棘手。然而随着MRI的广泛应用，其发现率有逐年增高之趋势。近年来，脊髓空洞形成前的最初始改变引起了国内外学者的注意，国内称之为空洞形成前期，国外称之为空洞前状态（Presyrinx state），对其进行研究有利于深入了解脊髓空洞症形成的病生理机制，为早期干预逆转这种初始改变、阻断空洞形成提供了可能。众所周知，水通道蛋白家族在机体内水分子跨膜转运发挥着重要作用，其中，水通道蛋白-4（Aquaporin-4，AQP4）在中枢神经系统表达最为丰富，在生理状态下参与了脑与脊髓水分子转运及平衡调节、电解质和渗透压平衡调节，在病理状态下参与了创伤、梗死、出血、炎症和肿瘤等所致的神经组织水肿形成。因此，本研究应用分子生物学技术研究了AQP4在实验性兔脊髓空洞前状态的表达变化，探讨了PKC对AQP4的调控作用，观察了甲基强的松龙对AQP4表达影响及减轻脊髓水肿的有益作用。本研究分四部分：1水通道蛋白-4在正常新西兰兔脊髓内的表达与分布本研究通过免疫组化、原文杂交和Western blot技术观察了AQP4在新西兰白兔脊髓的表达和定位，推测其可能的生理功能，为脊髓内水代谢的调节包括脊髓前状态脊髓水肿防治研究提供理论依据和有意的对比资料。8只体重1.5～2.0Kg的新西兰白兔在氯胺酮过度麻醉下，断头处死，经后入路取出颈、胸、腰段脊髓各3段，每段再分为3小部分，分别进行免疫组化、原位杂交和Western blot以检测AQP4及其mRNA在脊髓的表达和定位。实验结果：（1） Western blot显示，AQP4抗体从粗制的脊髓膜碎片中可探测出一条强烈的蛋白条带，含量比脑组织丰富；（2）免疫组化显示，在灰质，AQP4阳性着色看起来弥散于整个神经毡，只有神经元胞浆不着色。其中，后角的第Ⅰ、Ⅱ板层着色最深，自背侧向腹侧出现浓度递减的变化趋势，到了中间带和前角AQP4着色中等，存在呈明显的板层差异性分布；在白质，AQP4阳性着色集中在起白灰质并向脊髓表面放射的纤维胶质突起上，主要是星形胶质细胞的突起，或定向放射，或沿脊髓的外界和围绕血管形成胶质膜。总之，AQP4的阳性表达主要位于胶质细胞、神经元包括前角运动神经元的细胞膜上，中央管室管膜细胞呈阳性表达，以靠细胞膜基底侧较明显，脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、软脊膜上皮细胞胞膜也呈强阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞尤为突出。上述分布现象在脊髓不同节段无明显差异；（3）原位杂交显示，在灰质内，神经元、胶质细胞胞浆内均有不同程度的杂交信号，胞核未检测到。其中，中央管室管膜细胞和后角的胶质细胞均呈强阳性表达。白质内胶质细胞也呈强阳性表达。上述结果显示，AQP4广泛表达于脊髓灰质和白质，包括胶质细胞、神经元、中央管室管膜细胞、软脊膜细胞，着色部位主要在细胞膜，其中在胶质细胞表现出一定的极性，主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧。提示AQP4在新西兰白兔脊髓的定位和分布具有的特殊性与脊髓水分子转运及平衡调节有密切关系；与先前研究相比，证实兔与大鼠之间AQP4分布存在种属间差异。2 AQP4在实验性脊髓空洞前状态中的表达变化在观察了正常新西兰白兔脊髓内AQP4表达和分布的基础上，本部分对AQP4及其mRNA在兔脊髓空洞前状态的表达变化进行深入研究，以探讨其在空洞前状态脊髓水肿形成中的作用。将56只体重1.5～2.0Kg的新西兰兔随机分为3组（n=8），其中Kaolin组40只，生理盐水组和假手术组各8只。按McLaurin法经皮枕大池穿刺，缓慢抽出脑脊液0.6ml后，Kaolin组动物注入37℃、25％Kaolin悬浊液0.6ml；生理盐水组动物注入37℃生理盐水0.6ml；假手术组动物仅行枕大池假穿刺以作对照。术后每日，按改良Tarlov评分法对动物进行行为学评分。生理盐水组和假手术组在术后，Kaolin组在第1，3，7，14，21d各随机选取8只，断头处死，经后入路取出上颈髓，4mm颈髓标本用干湿重法测定脊髓含水量；2mm标本用RT-PCR测定AQP4 mRNA的表达；1cm颈髓用Western blot测定AQP4蛋白含量，剩余颈髓组织常规处理制作4μm石蜡切片，行免疫组化染色和HE染色观察。各组数据以均数±标准差表示（（?）±S），应用SPSS10.0专用统计软件进行单因素方差分析分析（ANOVA），以P＜0.05为差异显著性标准。结果显示，（1）神经功能改变：Kaolin组动物于术后第3d出现进食减少、精神萎靡，第7d出现神经功能障碍，包括反应迟钝、四肢无力，甚至瘫痪，并随时间延长逐渐加重，与生理盐水组和假手术组对比有显著差异（P＜0.05）。（2）脊髓含水量变化：Kaolin组动物于术后第1d脊髓含水量（68.35±0.70％）较对照组即有明显增加，第7d达到高峰（72.92±0.86％），第21d时有所缓解（70.03±0.77％），均高于对照组（P＜0.05）。（3）上颈髓病理变化：Kaolin组动物于术后第3d出现细胞、血管周围间隙增宽，表现为轻度水肿；第7d、14d水肿程度加重，细胞周围空隙明显增大，核膜、核仁稍显模糊，神经元胞体内尼氏体减少，胶质细胞增生，中央管饱满，室管膜细胞受压变平，管周组织疏松，呈明显水肿改变，蛛网膜下腔可见高岭土沉积，大量炎性细胞浸润；第21d组织结构明显紊乱，水肿稍显减轻但持续存在，胞浆出现空泡，前角细胞数量减少，胶质细胞增生明显，中央管张力增加，室管膜上皮断裂、脱落，Kaolin肉芽肿形成。生理盐水组和假手术组动物脊髓神经元轮廓正常，核及核仁清楚，胞浆内尼氏体分布均匀，胶质细胞正常。（4）免疫组化结果：Kaolin组动物上颈髓组织中，AQP4在神经元和胶质细胞胞膜均有表达，术后第1d与对照组动物比较无明显差别（IOD=344.7±29.6，IOD下略）（P＞0.05），但术后第3d开始减弱（320.5±44.2），第7～14d达到最低水平（267.4±28.8，258.7±26.5），到21d有所回升（321.5±46.1），但仍明显低于对照组（354.9±40.2）（P＜0.05）。（5） Western blot测定结果：生理盐水组和假手术组动物AQP4表达无显著差异（P＞0.05）；Kaolin组动物上颈髓组织中AQP4表达与生理盐水组相比，第1d没有显著差异（218.62±14.54）（P＞0.05），第3、7、14、21d时AQP4表达显著减弱，且以第7、14d下降最为明显（104.98±16.35，112.01±9.15），第21d时稍有恢复（131.68±9.36），但仍明显低于正常（P＜0.05）。（6）RT-PCR结果显示，AQP4 mRNA扩增条带为416bp大小，与对照组相比，Kaolin组动物脊髓组织中AQP4mRNA于术后第3d即有降低（0.83±0.05），第7d达到最低值（0.17±0.09），维持到14d，21d时回升（1.01±0.08）（P＜0.05）。（7）线性回归分析结果显示，脊髓组织中AQP4及其mRNA表达含量与脊髓含水量之间存在明显的负相关关系（r=-0.769，p＜0.01；r=-0.955，p＜0.01）。上述结果提示，脊髓空洞前状态演变过程中，AQP4及其mRNA表达减少，与脊髓水肿程度在时间和空间上存在负相关依存关系。提示AQP4及其mRNA表达减少，参与了空洞前状态缺血、缺氧性脊髓水肿的形成。3实验性兔脊髓空洞前状态中PKC对AQP4表达的调控作用PKC与脑水肿的关系早已受到人们的关注，最近研究显示其与AQP4在创伤性脑水肿形成中发挥重要作用。本研究通过采用底物磷酸化法测定胞浆和胞膜PKC活性的变化及其对AQP4的表达的影响，进而试图阐明二者在脊髓空洞前状态形成中的作用。将56只体重1.5～2.0Kg的新西兰兔随机分为3组（n=8），分组方法、模型制作和动物行为学评分同第二部分。生理盐水组和假手术组在术后，Kaolin组在第1，3，7，14，21d各随机选取各8只，断头处死，取出上颈髓。用干湿重法测定脊髓含水量、用RT-PCR测定脊髓AQP4mRNA的表达、用Western blot测定脊髓AQP4蛋白含量，部分颈髓组织常规处理后进行HE染色观察。再取100mg标本应用非放射性底物磷酸化法测定胞膜、胞浆PKC活性。统计学分析同第二部分。结果显示，（1）脊髓含水量、上颈髓病理变化、AQP4及其mRNA表达变化见第二部分。（2）Kaolin组动物上颈髓组织中，Kaolin注入后1d胞膜PKC活性就增加70％(5.67±0.26 pmol·min-1·mg-1protein，单位下略)，7～14d最加3倍之多（12.14±2.08，13.27±3.15），达到最高点，21d开始回落（8.85±1.56），仍高于正常（P＜0.05）。胞浆的PKC活性则呈相反趋势，术后1d出现降低（12.35±1.67），7～14d达到最低点（6.48±1.24，5.95±1.74），降幅达50％，21d开始回升（8.79±2.14），但仍低于对照组（P＜0.05）。（3）在同一时间点，随着脊髓组织膜性PKC活性增高，AOP4及其mRNA表达则下降。线性回归分析结果显示，脊髓组织中膜性PKC活性与脊髓AQP4及其mRNA之间存在明显的负相关关系（r=-0.910，p＜0.01；r=-0.899，p＜0.01）。上述结果提示，脊髓空洞前状态形成过程中神经细胞胞浆PKC活性明显下降，而胞膜PKC活性明显增加，出现了PKC移位激活。PKC移位激活，不但降低AQP4基因表达和蛋白含量，还对AQP4进行磷酸化修饰，导致AQP4活性降低，共同参与了空洞前状态缺血、缺氧性脊髓水肿的形成。4甲基强的松龙对脊髓空洞前状态AQP4表达和PKC活性的影响本部分通过应用MP进行干预，观察其对动物上颈髓组织中AQP4表达、PKC活性及其对脊髓含水量变化的影响，探讨MP减轻脊髓空洞前状态脊髓水肿的分子机理。将100只体重1.5-2kg的新西兰白兔随机分为3组：对照组20只、模型组和MP干预组各40只（n=8），按第二部分制作模型。其中，MP干预组于枕大池注射Kaolin后1～3d从兔耳缘静脉缓慢注入10mlMP（30mg／kg），4～7d减少MP用量（10mg／kg），静脉注射。模型对照组依同样方法给予生理盐水、正常对照组仅行枕大池假穿刺以作对照。MP组于术后立即白兔耳缘静脉静注用等渗生理盐水配制的大剂量MP（30mg／kg）10ml，20min滴完，术后第1～3d应用同样方法给予大剂量MP（30mg／kg），4～7d则应用同样方法给予MP（10mg／kg）。模型组仅制作模型不作任何干预。对照组仅行枕大池假穿刺。术后每日，按改良的Tarlov评分法对动物进行行为学评分，各组动物于第1，3，7，14，21d各随机选取各8只，断头处死，取出上颈髓。用干湿重法测定脊髓含水量、用RT-PCR测定AQP4 mRNA表达、用Western blot测定AQP4蛋白含量、部分颈髓组织常规处理后进行免疫组化染色和HE染色观察。再取100mg标本应用非放射性底物磷酸化法测定胞膜、胞浆PKC活性。各组数据以均数±标准差表示（（?）±S），应用SPSS10.0专用统计软件进行配对T检验，以P＜0.05为差异显著性标准。结果显示，（1）术后神经功能变化：MP组动物在各时间点的神经功能障碍程度较模型组明显减轻（p＜0.05）。但与正常对照组比较要差；（2）颈髓含水量测定：MP组动物颈髓含水量第1d 67.41±0.90％，第3d68.66±0.37％，第7d 69.00±0.70％，第14d 69.16±0.37％，第21d68.38±0.28％，与模型组相比各个时间点均明显降低（p＜0.05）；但较正常对照组仍高；（3）病理学变化：MP组动物于术后第7d才出现细胞、血管周围间隙增宽的水肿表现，并且高峰期推迟于术后第14d出现，第21d水肿减轻，这三个时间点脊髓水肿程度均明显低于模型组。同时动物颈髓神经元胞体内尼氏体减少及胶质细胞增生也较模型组明显减轻；（4）免疫组化结果：MP组动物颈髓AQP4表达于各时间点较模型组均明显增加（p＜0.05），仍保持第7、14d达最低点，21d又回升之趋势；（5）Western blot测定结果：与模型组相比，MP组动物上颈髓AQP4蛋白在各个时间点均明显增高，尤以术后7、14、21d为甚（p＜0.05）。与对正常照组相比，MP组动物颈髓AQP4表达于术后第1、3、21d有增高，第7、14d降至最低点且低于正常对照组。（6）RT-PCR结果：与模型组相比，MP组动物上颈髓AQP4 mRNA表达于术后第1d始明显增多，一直持续到21d，其中以7、14d增高最为显著（p＜0.05）。与正常对照组相比，MP组动物颈髓AQP4mRNA表达于术后第1、3d明显最高，第7、14d下降至低于正常对照组，21d时回升。（7）PKC活性测定结果：与模型组相比，在各个时间点，MP组动物上颈髓神经细胞胞膜和胞浆PKC活性明显下降，以7、14d最为显著，下降近50％。（p＜0.05）。上述结果显示，MP能够在基因和蛋白水平增加AQP4表达，同时通过抑制PKC活化间接增加AQP4活性，两者均利于水分子从胶质细胞或细胞外间隙跨过血脑屏障向血管腔和蛛网膜下腔转运、促进脊髓水肿的消散；MP对实验性兔脊髓空洞前状态脊髓水肿具有明显的减轻作用。结论1本研究首次应用免疫组化及原位杂交技术研究了AQP4在新西兰白兔脊髓的定位和分布，发现其与脊髓水分子转运及平衡调节有密切关系；与先前研究相比，证实兔与大鼠之间AQP4分布存在种属间差异。2首次研究了AQP4及其mRNA在实验性兔脊髓空洞前状态发病中的表达变化，明确了AQP4及其mRNA表达减少参与了空洞前状态缺血、缺氧性脊髓水肿的形成。3脊髓空洞前状态形成中出现了PKC的移位激活，其不但降低AQP4基因表达和蛋白含量，而且还对AQP4进行磷酸化修饰，导致AQP4活性降低，共同参与了空洞前状态缺血、缺氧性脊髓水肿的形成。4 MP能够在基因水平和蛋白水平增加AQP4表达，同时通过抑制PKC活化间接增加AQP4活性，两者均利于水分子从胶质细胞或细胞外间隙跨过血脑屏障向血管腔和蛛网膜下腔转运，促进脊髓水肿的消散，对兔脊髓空洞前状态脊髓水肿具有明显的减轻作用。
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