家猫卵巢组织的超低温冷冻保存研究

论文摘要

本试验通过两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液VS1和玻璃冷冻法溶液DAP213四种处理冷冻保存了50只家猫的卵巢皮质薄片。通过对新鲜和冷冻复苏后的卵巢组织进行组织学观察、电镜观察,分离冷冻后卵巢组织的卵泡进行体外培养并检测培养液中雌激素水平,从而检验猫科动物卵巢组织在超低温冷冻后是否保存活性,进而选择一种较为适合猫科动物卵巢组织保存的冷冻方法。 组织学切片显示,四种冷冻处理以玻璃化冷冻法溶液VS1处理组对卵巢组织、卵泡正常形态造成的损伤较小。电镜观察可见在冷冻保存后卵母细胞的超微结构如:透明带、微绒毛、微管和皮质颗粒等受到了不同程度的破坏。 使用酶法结合机械法分离卵泡,平均每只家猫可获得卵泡33.78个。用台盼兰死活染色计算卵泡存活率,两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液VS1和玻璃冷冻法溶液DAP213四种处理得到的卵泡存活率分别为34.5%,40.0%,53.4%和47.2%。 经过四种处理冷冻保存的卵巢组织,复苏后分离得到的直径为100～210μm的卵泡333个用于体外培养,四种处理后分离的卵泡均保持了继续生长的能力,其中有一个卵母细胞经体外培养发育并排出第一极体。经两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液VS1和玻璃冷冻法溶液DAP213冷冻保存后分离得到的卵泡培养4d时卵泡退化率为86.88%、65.63%、68.45%和56.86%,四种方法间差异不显著;存活卵泡直径与其开始培养时相比增长幅度分别为6.75μm、7.33μm、8.45μm和6.68μm,四种方法间差异不显著。本试验用酶联法测定卵泡体外培养液中17β-E2水平,所有样本均有阳性反应,其中测得三个样本中17β-E2含量分别为5.882 pg/50μl、2.951 pg/50μl和1.299pg/50μl。表明四种方法冷冻后的颗粒细胞均具有活性,保持了分泌雌激素的功能。 通过对冷冻后卵巢组织活性的检验,四种方法冷冻保存后的卵巢组织均具有活性。其中玻璃冷冻法溶液VS1组冷冻效果较好。

论文目录

• 1 前言
• 1.1 卵巢组织冷冻保存的研究价值和意义
• 1.2 卵巢组织冷冻保存研究概况
• 1.2.1 冷冻卵巢研究的发展
• 1.2.2 冷冻方法
• 1.2.3 冷冻保护剂
• 1.2.4 其他影响冷冻效果的因素
• 1.2.5 冷冻卵巢组织的应用
• 1.3 卵泡体外培养体系
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 卵巢组织薄片的冷冻保存与复苏
• 2.2.2 组织学观察
• 2.2.3 电镜观察
• 2.2.4 卵泡分离
• 2.2.5 台盼兰染色法测定活率
• 2的测定'>2.2.6 腔前卵泡的体外培养及培养液中17β-E₂的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 新鲜、冷冻组织切片
• 3.2 冷冻对组织超微结构的影响
• 3.3 卵泡分离结果
• 3.4 冷冻复苏后卵泡的活率
• 3.5 卵泡体外培养
• 3.6 激素水平测定结果
• 4 讨论
• 4.1 冷冻造成的损伤与冷冻方案的设计
• 4.2 不同分离方法对卵泡分离效果的影响
• 4.3 家猫卵泡体外发育能力
• 4.4 研究工作展望
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢