黄瓜花叶病毒M和Fny株系假重组体在系统侵染的烟草中的基因表达分析

论文摘要

黄瓜花叶病毒（CMV）,世界普遍发生,侵染数百种植物,经济意义重大。本研究采用侵染性克隆、病毒假重组和实时荧光PCR等技术,对CMV致病与恢复机理进行了初步探索。克隆测定了CMV-M株系全基因组RNA1、RNA2和RNA3序列,并克隆到p UC18载体,分别得到全长cDNA克隆pM1、pM2和pM3。用CMV-Fny和CMV-M （RNA2和RNA3）全长cDNA克隆体外转录RNA进行假重组,成功构建3个具有侵染活性的假重组病毒（F1M3F3、F1F2M3、F1M2M3）。在白肋烟上分别产生坏死环斑、轻微绿斑驳、明脉、黄白化、叶尖线性化等症状。根据假重组型病毒与野生型病毒症状差异,初步判定：CP基因是诱导花叶症状的关键因子,CMV-Fny RNA2是诱导叶尖线性化的关键因子,CMV-M RNA2是诱导叶尖坏死斑关键因子。设计了CMV RNA1、RNA2、RNA3、RNA4特异检测引物和实时荧光定量PCR （FQ-PCR）探针,用FQ-PCR定量分析了CMV-Fny、CMV-M及其假重组体4种RNA的变化规律。结果表明：在接种15d时,发病叶片、恢复初期叶片中病毒RNA1、RNA2、RNA3浓度没有实质性差异,但恢复叶中的RNA4浓度相比下降5倍,说明RNA4和恢复机制有着更加直接的关系；接种30d,发病叶片、恢复初期叶片中病毒RNA浓度显著下降,其中恢复叶中RNA降解程度最为严重,RNA1、RNA2、RNA3、RNA4浓度分别下降了36、139、100、320倍,说明在恢复叶中存在一个更加强大的RNA降解机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号表
• 一 引言
• 1.1 植物病毒研究方法
• 1.1.1 生物学研究方法
• 1.1.2 电子显微镜技术和物理化学分析方法
• 1.1.3 血清学/免疫学方法
• 1.1.4 分子生物学技术
• 1.2 黄瓜花叶病毒研究进展
• 1.2.1 CMV特性
• 1.2.2 CMV分类
• 1.2.3 CMV传播途径
• 1.2.4 CMV致病机制研究现状
• 1.2.5 CMV恢复机制研究现状
• 1.3 研究目的和意义
• 1.4 主要研究内容
• 二 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 寄主材料
• 2.1.2 CMV株系
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 引物和探针
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 摩擦接种
• 2.2.2 CMV-M病毒粒子提纯
• 2.2.3 植物总RNA提取
• 2.2.4 琼脂糖电泳
• 2.2.5 cDNA合成与克隆
• 2.2.6 PCR产物纯化回收
• 2.2.7 T载体连接
• 2.2.8 转化感受态细胞
• 2.2.9 质粒提取
• 2.2.10 挑菌测序及序列分析
• 2.2.11 体外转录
• 2.2.12 各重组体接种及其生物活性测定
• 三 结果
• 3.1 CMV-M侵染性克隆和假重组体构建
• 3.1.1 CMV-M全长CDNA克隆和基因序列分析
• 3.1.2 CMV-M全长CDNA克隆侵染性分析及假重组体构建
• 3.1.3 假重组体接种后症状
• 3.2 CMV-M基因表达时序变化监测
• 3.2.1 CMV-M侵染烟草症状的时序变化
• 3.2.2 标准曲线
• 3.2.3 CMV-M病毒粒子时序变化检测
• 3.2.4 CMV-M病毒基因组RNA时序变化检测
• 3.3 CMV-FNY基因表达时序变化监测
• 3.3.1 CMV-FNY侵染烟草症状
• 3.3.2 CMV-FNY病毒粒子时序变化检测
• 3.3.3 CMV-FNY基因组RNA时序变化检测
• 3.4 F1F2M3基因表达时序变化监测
• 3.4.1 F1F2M3侵染烟草症状
• 3.4.2 F1F2M3病毒粒子时序变化检测
• 3.4.3 F1F2M3基因组RNA时序变化检测
• 3.5 F1M2M3基因表达时序变化监测
• 3.5.1 F1M2M3侵染烟草症状
• 3.5.2 F1M2M3病毒粒子时序变化检测
• 3.5.3 F1M2M3基因组RNA时序变化检测
• 3.6 假重组体F1M3F3基因表达时序变化监测
• 3.6.1 F1M3F3侵染烟草症状
• 3.6.2 F1M3F3病毒粒子时序变化检测
• 3.6.3 F1M3F3基因组RNA时序变化检测
• 四 结论和分析
• 4.1 CMV-M RNA1侵染性克隆活性低的原因分析
• 4.2 CMV各基因的功能分析
• 4.3 症状发展与病毒粒子含量变化的相关性
• 4.4 症状发展与病毒基因组RNA含量变化的相关性
• 4.4.1 CMV-M野生型
• 4.4.2 CMV-FNY野生型
• 4.4.3 F1F2M3
• 4.4.4 F1M2M3
• 4.5 CMV-M、F1F2M3和F1M2M3症状发展差异分析
• 4.6 CMV-M恢复现象的原因分析
• 4.7 F1M3F3症状发展的原因分析
• 4.8 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历