基于微孔板核酸杂交酶联免疫吸附法检测DNA结合蛋白

论文摘要

转录因子,也被称为序列特异性DNA结合蛋白,含有一个或多个DNA结合结构域（DBDs）。它们定位于细胞质中,在正常细胞功能状态下或受到特定因子诱导后,从细胞质进入细胞核,与基因组中的顺式作用元件诸如启动子、增强子、衰减子等发生特异性识别结合,组成基因转录机器,进而实现其调控基因表达的功能。因此,检测分析转录因子的表达及活化程度对我们了解细胞功能具有至关重要的作用。目前常用的检测技术主要建立在DNA和蛋白质相互作用这一层次,即运用含有顺式作用元件的DNA为探针,来分析转录因子的DNA结合活性。本课题“基于微孔板核酸杂交酶联免疫吸附法检测DNA结合蛋白”技术巧妙的利用在高严谨度洗脱条件下转录因子蛋白对与之特异性结合的双链核酸序列的保护作用,将对转录因子的检测转换为对相应的特异核酸序列的检测。该方法不需要复杂的仪器、繁琐的操作步骤和特异性抗体就可以对转录因子的表达及活化程度进行定量研究,而且可在较短时间内完成对转录因子的检测。我们以检测转录因子c-Jun的活性为模型来对该检测方法进行评价,在较短的时间内该方法可以准确的检测到3.5ng的转录因子c-Jun纯蛋白和0.625ug的Hela细胞核粗提取物,具有较高的灵敏度。而且该检测方法可以用于任何一种转录因子的检测。鉴于“基于微孔板核酸杂交酶联免疫吸附法”的快速、简便、高灵敏度和选择性,该检测方法可以应用到需要对转录因子的DNA结合活性进行定量,有效,大规模检测的领域和科学研究中,诸如细胞分子生物学中对多种处理的刺激应答筛选方面,进化生物学研究方面,环境监测方面和药物筛选方面等等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 DNA binding protein
• 1.2 转录因子的概况
• 1.2.1 转录因子
• 1.2.2 转录因子的功能
• 1.2.3 转录因子检测技术研究现状
• 1.3 微孔板核酸杂交ELISA 技术
• 1.3.1 微孔板核酸杂交ELISA 的概念及应用
• 1.3.2 严谨度杂交
• 1.4 研究目的意义、基础和创新之处
• 1.4.1 研究的目的和意义
• 1.4.2 研究的创新之处
• 1.5 研究原理和技术路线
• 1.5.1 转录因子检测研究的原理
• 1.5.2 转录因子检测研究的技术路线
• 第二章 实验材料与仪器
• 2.1 主要试剂及材料
• 2.2 主要仪器
• 第三章 实验方法
• 3.1 微孔板的制备
• 3.1.1 核酸序列的设计和合成
• 3.1.2 微孔板的包被和封闭
• 3.1.3 单链核酸的固定
• 3.2 细胞粗提物的制备
• 3.2.1 细胞的复苏与传代培养
• 3.2.2 细胞粗提物的制备
• 3.2.3 纯c-Jun 蛋白的检测
• 3.2.4 细胞核粗提取物中 c-Jun 的检测
• 3.2.5 灵敏度测试
• 3.2.6 特异性测试
• 3.2.7 EMSA 方法检测验证
• 第四章 结果与讨论
• 4.1 检测体系的确定
• 4.1.1 显色探针核酸序列长度的选择
• 4.1.2 固定探针浓度的选择
• 4.1.3 显色时间的确定
• 4.1.4 讨论
• 4.2 c-Jun 纯蛋白的检测
• 4.2.1 c-Jun 纯蛋白的检测
• 4.2.2 讨论
• 4.3 检测方法的特异性
• 4.3.1 从蛋白方面验证特异性
• 4.3.2 从核酸方面验证特异性
• 4.3.3 讨论
• 4.4 检测方法的灵敏度考察
• 4.4.1 灵敏度测试
• 4.4.2 讨论
• 4.5 Hela 细胞核粗提取物的检测
• 4.5.1 Hela 细胞核粗提取物中转录因子的检测
• 4.5.2 讨论
• 4.6 EMSA 方法的检测验证
• 4.6.1 EMSA 方法检测结果
• 4.6.2 讨论
• 第五章 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他科研成果