感染猪链球菌2型后细胞因子的变化以及分泌核酸酶A的生物学研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病原菌。根据荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）抗原成分不同,可以将猪链球菌分为35个血清型（1—34型和1/2型）。其中猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）是最常见也是毒力最强的血清型。猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可感染相关人员并致死。有报道表明,一些炎性因子和趋化因子的超量表达与细菌导致的脑膜炎症有关。而猪链球菌2型引起血液中大量细胞因子的表达,可能也是猪链球菌2型突破血脑屏障的可能机制之一。本实验利用荧光定量PCR定量IL-1α,IL-1β,TNF-α,IL-8,IL-10,IFN-γ等细胞因子的表达情况,并分析感染猪链球菌2型后这些细胞因子的表达差异情况。结果显示,与IL-1β和IL-10相比,IL-1α,TNF-α,IL-8和IFN-γ有很大程度的升高,IL-1β在整个检测过程中多比较弱,TNF-α在9H就开始升高,在42H达到顶峰。IL-8在攻毒后即有明显的升高。通过这个分析,我们希望能为解释猪链球菌2型的致病特征提供一定的理论信息。为更好的防治猪链球菌2型提供理论基础。猪链球菌的致病性与其毒力因子相关,目前猪链球菌的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白、胞外因子、溶血素、荚膜多糖等。近年来,还发现了一些潜在的毒力因子,主要有:分泌核酸酶（Secreted Nuclease A,SsnA）、38KD免疫保护性抗原、致病性基因-orf2等。研究表明,分泌核酸酶A（SsnA）的表达水平和分离的位置有密切大关系。即深层组织分离的细菌大部分表现为SsnA阳性,而浅层组织分离菌则表现为阴性。针对这一现象,推测SsnA蛋白可能可以作为区分猪链球菌感染已否的一个指标。本实验针对SsnA这一特点,克隆表达了SsnA蛋白,经蛋白纯化,可达浓度90%。利用纯化的SsnA蛋白建立ELISA方法,来区分猪链球菌感染和免疫。结果显示,将384份免疫阳性血清用SsnA包被的ELISA板（SsnA-ELISA）检测,共有88份血清OD630＞0.4,即为阳性,阳性率为22.9%。而在37份感染的血清中,用荚膜多糖（CPS）检测均为阳性。用SsnA纯化蛋白包被的ELISA检测,有30份血清OD630＞0.4,阳性率为81.1%。结果初步说明,SsnA是可以作为猪链球菌区分感染与免疫的一个指标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 猪链球菌2型的研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 毒力因子
• 3.1 荚膜多糖
• 3.2 溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）
• 3.3 猪链球菌溶血素（suilysin）
• 3.4 黏附素
• 3.5 IgG结合蛋白
• 3.6 纤维蛋白原结合蛋白（FBPS）
• 3.7 其它毒力相关因子
• 3.7.1 分泌型核酸（secreted nuclease A,SsnA）
• 3.7.2 致病性基因—orf2
• 3.7.3 38Kd免疫保护性抗原
• 3.7.4 猪链球菌类细菌素抑制物
• 4 致病机理
• 5.猪链球菌的鉴定
• 5.1 生化鉴定
• 5.2 血清学鉴定
• 5.3 分子鉴定
• 5.3.1 限制性内切酶图谱分析法
• 5.3.2 PCR
• 5.3.3 随机扩增核酸片段多肽性分析（RAPD）
• 6.预防和治疗
• 7.协同性致病因子
• 第二章 感染猪链球菌2型后猪外周血细胞因子的变化
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 猪链球菌2型的培养
• 2.2.2 猪链球菌2型计数
• 2.2.3 动物致病性实验
• 2.2.4 白细胞RNA的提取
• 2.2.5 cDNA的合成
• 2.2.6 引物设计,合成和融解曲线的检测
• 2.2.7 cDNA PCR扩增鉴定和RNA样品中DNA检测
• 2.2.8 荧光定量反应
• 2.2.9 数据处理
• 3 结果
• 3.1 猪的临床症状
• 3.2 cDNA PCR扩增鉴定和RNA样品中DNA检测
• 3.3 荧光定量PCR的融解曲线
• 3.4 荧光定量PCR扩增细胞因子结果
• 4 讨论
• 4.1 DNA的定量的研究
• 4.2 各个细胞因子mRNA的表达
• 5 小结
• 第三章 分泌核酸酶（SsnA）的生物学特性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.3 一抗和二抗
• 2.1.4 免疫动物
• 2.1.5 主要试剂及溶液的配制
• 2.1.6 细菌培养基
• 2.1.7 质粒抽提相关溶液
• 2.1.8 SDS-PAGE相关溶液
• 2.1.9 Western-blot及蛋白质斑点杂交缓冲液
• 2.1.10 ELISA相关溶液
• 2.1.11 其他
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 基因组DNA的提取
• 2.2.3 分泌核酸酶（SsnA）基因的克隆
• 2.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.5 PCR产物与pET-28a载体的连接
• 2.2.6 感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.7 连接产物及质粒的转化
• 2.2.8 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 2.2.9 重组表达质粒的转化和鉴定
• 2.2.10 大肠杆菌BL21（DE3）的诱导表达
• 2.2.11 确定最佳的诱导表达条件
• 2.2.12 小量诱导
• 2.2.13 大量诱导
• 2.2.14 多克隆抗体的制备
• 2.2.14.1 免疫原的制备
• 2.2.14.2 免疫程序
• 2.2.14.3 ELISA检测免疫动物的抗体水平
• 2.2.15 表达蛋白的鉴定
• 2.2.15.1 SDS-PAGE
• 2.2.15.2 Western-blot实验
• 2.2.16 表达蛋白的纯化
• 2.2.16.1 上清蛋白的提取
• 2.2.16.2 镍亲和层析法（HisBind Purification Kit）
• 2.2.17 表达蛋白保护力效果测定
• 2.2.17.1 昆明鼠保护力实验
• 2.2.17.2 仔猪保护力实验
• 2.2.18 建立ELISA方法测定感染血清与免疫血清
• 2.2.18.1 ELISA最佳反应条件的选择
• 2.2.18.2 ELISA具体操作步骤
• 2.2.18.3 ELISA阴阳血清界限的确立
• 2.2.18.4 分析特异性实验
• 2.2.19 SsnA细胞免疫的检测
• 2.2.19.1 小鼠脾淋巴细胞的制备
• 2.2.19.2 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-γ相对表达水平
• 2.2.19.2.1 免疫小鼠脾淋巴细胞总RNA的提取
• 2.2.19.2.2 cDNA的合成
• 2.2.19.2.3 SYBR GreenI实时定量PCR
• 2.2.19.2.4 相对mRNA表达水平的计算
• 2.2.20 猪链球菌35个血清型SsnA基因PCR扩增
• 2.2.21 SsnA基因突变体质粒构建
• 2.2.21.1 引物设计
• 2.2.21.2 基因组DNA的提取
• 2.2.21.3 左臂和右臂的扩增
• 2.2.21.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.21.5 PCR产物与pSET4s载体的连接
• 2.2.21.6 感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.21.7 连接产物及质粒的转化
• 2.2.21.8 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 2.2.21.9 重组质粒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 SsnA的克隆,连接和鉴定
• 3.2 重组SsnA的表达及Western blot鉴定
• 3.3 重组SsnA蛋白的纯化
• 3.4 重组SsnA蛋白的保护力效果测定
• 3.5 ELISA方法的初步建立
• 3.5.1 ELISA方法抗原最佳包被浓度和血清稀释浓度的确定
• 3.5.2 ELISA方法最佳阴阳界定值的确立
• 3.5.3 分析特异性实验
• 3.5.4 ELISA方法检测感染血清与免疫血清
• 3.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达
• 3.7 35个血清型SsnA基因PCR扩增
• 3.8 SsnA基因突变体质粒鉴定
• 4 讨论
• 4.1 SsnA的蛋白纯化
• 4.2 分泌核酸酶A（SsnA）作为区分猪链球菌感染与免疫的指标
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢