与甘蓝型油菜脂肪酸组分形成相关新基因的克隆

论文摘要

本研究以甘蓝型油菜“湘油15”不同发育时期的种子为对象,首先确定了种子发育过程中由淀粉合成到油脂储藏两个关键时期,在此基础上克隆了甘蓝型油菜脂肪酸组分形成相关新基因,并进行了功能的深入研究,为进一步了解各种脂肪酸合成的酶学反应步骤和分子调控机理奠定了基础,具有重要的理论意义,同时在高品质油菜品种的选育上有非常重要的应用价值。1.利用测序和序列比对的方法找出白菜和甘蓝的Fad2基因上6个能进行A/C组分型的SNP多态性位点,依据SNP位点设计的引物建立了一套能快速检测甘蓝型油菜种子内不同来源Fad2基因表达的方法。通过对甘蓝型油菜A组和C组Fad2基因表达模式的分析,发现Fad2-A和Fad2-C分别与影响甘蓝型油菜种子没酸形成的两个基因H02和HO1相对应。2.利用消减抑制杂交技术构建了20DAP和35DAP甘蓝型油菜湘油15种子特异表达基因的SSH文库。在20DAP和35DAP SSH文库中随机挑选489个阳性克隆进行单向测序,获得452条高质量的表达序列标签（EST）。对序列进行Blast比对及功能注释,比较20DAP和35DAP SSH文库的基因表达谱,发现在35DAP SSH库中,与脂肪酸储存有关的油体蛋白家族、与脂肪酸转运有关的柠檬酸合酶、与脂肪酸合成有关的酰基载体蛋白去饱和酶等与油脂代谢相关的基因出现频率较高。此外还有许多仅在拟南芥中有报道而在油菜中功能未知的基因以及完全没有报道过的新基因。这些功能未知序列为我们克隆油菜中与脂肪酸组分形成相关的新基因奠定了基础。3.BnaLCR78是油菜中一个功能未知的基因。生物信息学分析发现,BnaLCR78基因编码一个由79个氨基酸组成且富含半胱氨酸的低分子量分泌蛋白。它与拟南芥中的LCR基因家族具有相似的结构和序列特征。在拟南芥中,LCR基因家族有86个成员,依据序列的同源性可以分为6个亚族,其中已报道具有植物防御功能的11个蛋白主要出现在第一亚族,而BnaLCR78则与功能还未见报道的第四亚族的同源性最高。4.为了验证BnaLCR78基因的功能,构建了一系列的表达载体。包括含35S启动子的过表达载体,种子特异性表达的载体和干扰载体等。并成功将BnaLCR78基因全长导入拟南芥,获得了不同部位表达的转基因拟南芥株系。另外,还筛选到与BnaLCR78同源性最高的拟南芥LCR家族基因LCR23突变体。从分子表达水平分析发现,BnaLCR78和LCR23基因都属于种子特异性表达,由此推测BnaLCR78基因与LCR23基因具有相同的功能。5.LCR家族另一个已经报道的功能是与花粉在柱头上的相互识别有关,能协助完成授粉过程。这类基因在功能缺失时会导致花粉管不能正确的找到珠孔,从而不能完成受精。本研究利用碱性苯胺蓝对LCR23基因突变体和转BnaLCR78基因拟南芥授粉后的花柱进行染色发现,花粉管都能准确的找到珠孔并在两小时内完成受精,说明LCR23蛋白对拟南芥的授粉过程没有产生影响。而BnaLCR78蛋白是否参与拟南芥和油菜的授粉过程,还有待进一步研究。6.气质联用仪测定拟南芥种子脂肪酸组分含量百分比。与野生型相比,LCR23突变体中的二十碳烯酸的含量降低了约14个百分点,芥酸含量提高了约7个百分点,而二十碳二烯酸的含量则降低到零。芥酸和二十碳二烯酸分别是脂肪酸合成过程中花生烯酸碳链延伸和脱饱和两条途径上的下游产物。推测LCR23基因可能作为一个分子开关调节芥酸与二十碳二烯酸的合成,参与脂肪酸代谢的过程,这是LCR家族从未被报道过的一个新功能。对它的阐释将对油菜脂肪酸代谢调控的研究和高品质油菜的育种具有很高的理论意义和实践指导价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 1 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 项目来源与经费支持
• 2 国内外油菜油脂的研究进展
• 2.1 油菜主要脂肪酸组分的种类
• 2.2 植物脂肪酸和甘油三脂的代谢途径
• 2.3 脂肪酸代谢过程中的酶
• 2.3.1 乙酰-CoA羧化酶
• 2.3.2 脂肪酸合成酶（FAS）
• 2.3.3 脂肪酸去饱和酶
• 2.3.4 超长链脂肪酸延长酶
• 2.3.5 三酰甘油组装酶系
• 3 研究目标和主要研究内容
• 3.1 研究目标
• 3.2 主要研究内容
• 4 本研究的技术路线
• 第一章 甘蓝型油菜A/C组Fad2基因的SNP分型与表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试品种
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 载体与质粒
• 1.1.4 分子生物学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 油菜总DNA的提取
• 1.2.2 PCR扩增
• 1.2.3 PCR产物回收
• 1.2.4 PCR产物的测序和比对
• 1.2.5 等位基因特异PCR引物设计
• 1.2.6 Fad2基因的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 同源性比对分析
• 2.2 等位基因特异PCR引物设计及PCR检测
• 2.3 Fad2基因的表达模式
• 3 讨论
• 第二章 甘蓝型油菜种子不同发育时期SSH文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 种子总RNA的分离与纯化
• 1.3 第一链cDNA合成
• 1.4 第二链cDNA合成与纯化
• 1.5 RsaI消化与纯化
• 1.6 加接头
• 1.7 杂交反应
• 1.8 PCR扩增
• 1.9 SSH cDNA文库的构建
• 1.10 序列测定和Blast分析
• 2 结果与分析
• 2.1 甘蓝型油菜种子总RNA质量检测
• 2.2 第一链合成和LD-PCR扩增
• 2.3 抑制消减杂交
• 2.4 差异表达cDNA文库的PCR产物检测
• 2.5 EST测序分析
• 2.5.1 开花后35天SSH文库EST序列的功能分析
• 2.5.2 开花后20天SSH文库EST序列的功能分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 甘蓝型汕菜BnaLCR78基因生物信息学分析及表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 电子克隆BnaLCR78全长基因
• 1.3 BnaLCR78基因生物信息学的分析
• 1.4 构建BnaLCR78基因的表达载体
• 1.4.1 种子总RNA的分离与纯化
• 1.4.2 cDNA第一链的合成
• 1.4.3 BnaLCR78基因的克隆
• 1.4.4 表达载体的构建
• 1.4.5 工程菌转化
• 2 结果与分析
• 2.1 BnaLCR78基因的电子克隆
• 2.2 BnaLCR78蛋白的二级结构
• 2.3 BnaLCR78的同源性分析
• 2.4 BnaLCR78基因表达载体的构建
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 BnaLCR78基因全长克隆
• 2.4.3 BnaLCR78-pHB载体的构建
• 2.4.4 BnaLCR78-B1载体的构建
• 2.4.5 其他表达载体的构建
• 3 讨论
• 3.1 BnaLCR78基因与LCR家族的关系
• 3.2 研究BnaLCR78基因的功能的方法
• 第四章 BnaLCR78基因的功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试材料
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 质粒载体
• 1.1.4 仪器设备
• 1.1.5 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥的转化
• 1.2.2 突变体纯和子的筛选
• 1.2.3 转基因拟南芥与突变体的表型观察
• 1.2.4 转基因拟南芥与突变体脂肪酸含量的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 卡拉霉素筛选拟南芥的浓度确定
• 2.2 F78B1和N78B1转化拟南芥的筛选结果
• 2.3 突变体纯和子的筛选
• 2.4 突变体BnaLCR78与LCR23基因的表达
• 2.5 扫描电镜观察结果
• 2.6 授粉后花粉管染色观察结果
• 2.7 拟南芥种子脂肪酸组分的测定
• 3 讨论
• 全文总结与创新点
• 1 总结
• 2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介