论文摘要
糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病,但目前在研究糖尿病发病机理过程中,缺乏动物胰岛素作为研究试剂,只能用人的胰岛素来替代,造成很多问题。因此,克隆和表达大鼠胰岛素具有重要的应用价值。我们使用基因工程的方法克隆大鼠胰岛素原基因编码序列并在大肠杆菌中进行高效表达。我们提取大鼠胰腺组织的总RNA,并逆转录成cDNA,扩增大鼠胰岛素编码基因的外显子序列,克隆入pGEM-T Easy载体。测序证实序列正确后,将目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa,转化入E.coli M15[pREP4],进行融合表达。SDS-PAGE电泳查看表达产物大小和表达量,Western-blotting进一步鉴定。将重组质粒pQE-30Xa/proinsulin优化表达条件进行大量表达,Proinsulin的表达量达到19mg/L培养基。重组蛋白胰岛素原占菌体蛋白的28.24%。目的蛋白含6×His纯化标签,可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni2+-IDA树脂层析柱,冲洗除去非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,利用Ni2+IDA蛋白纯化层析柱对大量表达产物进行蛋白纯化。对纯化的蛋白进行酶切,对酶切产物再次利用Ni2+柱纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE鉴定,得到成熟的胰岛素。进行酶联免疫吸附测定,结果表明有良好的活性。进行了大肠杆菌高密度发酵的初步探索,获得湿菌26g/L。
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