玉米大斑病菌漆酶基因StLAC在黑色素合成中的功能分析

论文摘要

为研究玉米大斑病菌漆酶基因在黑色素合成及致病过程中的作用,本研究首次发现漆酶可以促进玉米大斑病菌在寄主玉米组织中的扩展;利用同源重组的方法获得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1的敲除突变体;通过对突变体进行分析,明确了StLAC1基因在黑色素合成中起着关键作用;利用PCR和RACE技术获得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC2的全长序列,同源性分析确定了StLAC2与StLAC1基因编码氨基酸序列间的相似性为29.22%;主要研究结果如下:1.对玉米大斑病菌及9种常见植物病原真菌进行漆酶活性比较,发现供试菌株均具有漆酶活性和降解木质素的能力;漆酶活性测定结果表明,玉米大斑病菌的胞内漆酶活性较高,为18.984 U·mL-1;致病力测定发现,在玉米大斑病菌的致病过程中,漆酶可以促进病原菌在寄主组织中的扩展。2.利用基因敲除技术,通过PEG介导转化法将构建好的玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1的敲除载体转化玉米大斑病菌野生型菌株原生质体,经潮霉素筛选获得了潮霉素抗性转化子,利用PCR、Southern blot及RT-PCR技术进行验证,获得了StLAC1基因的功能缺失突变体△StLAC1。3.对突变体△StLAC1进行表型分析发现,△StLAC1菌落呈灰白色,黑色素合成受阻,菌丝透明且呈不规则状,不产生分生孢子,生长速率减慢,渗透调节能力增强,附着胞膨压、侵染能力显著降低,漆酶活性有所降低。说明StLAC1基因在玉米大斑病菌黑色素合成、附着胞穿透力和分生孢子形成等方面具有重要作用。4.利用PCR和RACE技术,获得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC2的全长序列。通过对该基因的结构进行分析,确定了其DNA全长1 763 bp,含有3个外显子,2个内含子;cDNA为1 665 bp,编码554个氨基酸。同源性分析发现,StLAC2基因编码的氨基酸序列与许多其他真菌漆酶具有45%76%的相似性,与已知StLAC1基因编码的氨基酸序列间相似性仅为29.22%。聚类分析发现,Stlac1和Stlac2属于进化树中不同的分支,二者亲缘关系较远。保守结构域分析发现,Stlac1和Stlac2都含有铜离子的结合位点。Southern blot分析,确定了StLAC2基因在玉米大斑病菌基因组中是以单拷贝形式存在的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 主要试剂及其配制
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 玉米大斑病菌漆酶活性分析
• 2.2.1 玉米大斑病菌平板显色反应比较
• 2.2.2 漆酶活力测定
• 2.2.3 漆酶对玉米大斑病菌致病力的影响
• 2.3 玉米大斑病菌STLAC1 基因敲除突变体的获得
• 2.3.1 StLAC1 基因重组质粒的提取与酶切验证
• 2.3.2 同源重组载体转化玉米大斑病菌原生质体
• 2.3.3 转化子的筛选
• 2.3.4 转化子基因组DNA 的提取
• 2.3.5 转化子的PCR 鉴定
• 2.3.6 转化子的Southern blot 验证
• 2.3.7 转化子总RNA 提取及第一链cDNA 的合成
• 2.3.8 转化子的半定量RT-PCR 分析
• 2.4 玉米大斑病菌STLAC1 基因敲除突变体分析
• 2.4.1 突变菌株生长发育分析
• 2.4.2 突变菌株漆酶活性的测定
• 2.4.3 突变菌株的胞内黑色素分析
• 2.4.4 突变菌株附着胞膨压的测定
• 2.4.5 突变菌株的渗透调节能力分析
• 2.4.6 突变菌株的细胞壁降解酶活性分析
• 2.4.7 突变菌株HT-毒素活性分析
• 2.5 玉米大斑病菌STLAC2 基因全长的克隆及生物信息学分析
• 2.5.1 玉米大斑病菌总RNA 提取及第一链cDNA 的合成
• 2.5.2 玉米大斑病菌基因组DNA 提取
• 2.5.3 玉米大斑病菌StLAC2 基因同源片段的获得及基因全长引物的设计
• 2.5.4 5′RACE 技术获得StLAC2 同源片段上游序列
• 2.5.5 PCR 扩增产物的克隆
• 2.5.6 基因的拼接
• 2.5.7 StLAC2 基因开放阅读框（ORF）的扩增
• 2.5.8 基因结构及功能的生物信息学分析
• 2.5.9 玉米大斑病菌漆酶基因相似性的聚类分析及保守结构域的鉴定
• 2.6 玉米大斑病菌STLAC2 基因的拷贝数分析
• 2.6.1 探针制备
• 2.6.2 限制性内切酶酶切基因组DNA
• 2.6.3 电泳、转膜、杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米大斑病菌漆酶活性分析
• 3.1.1 平板显色反应比较
• 3.1.2 漆酶活力测定
• 3.1.3 漆酶致病力分析
• 3.2 玉米大斑病菌漆酶基因STLAC1 的功能分析
• 3.2.1 StLAC1 重组载体的酶切验证
• 3.2.2 玉米大斑病菌原生质体的再生及转化子筛选
• 3.2.3 转化子的PCR 鉴定
• 3.2.4 转化子的Southern blot 验证
• 3.2.5 转化子的半定量RT-PCR 分析
• 3.2.6 突变菌株的形态学特征
• 3.2.7 突变菌株的产孢量
• 3.2.8 突变菌株菌丝的显微观察
• 3.2.9 突变菌株漆酶活性的测定
• 3.2.10 突变菌株的胞内黑色素分析
• 3.2.11 突变菌株附着胞膨压的测定
• 3.2.12 突变菌株的渗透调节能力分析
• 3.2.13 突变菌株的细胞壁降解酶活性分析
• 3.2.14 突变菌株HT-毒素活性分析
• 3.3 STLAC2 基因全长的克隆与结构分析
• 3.3.1 StLAC2 基因5′-末端cDNA 的克隆
• 3.3.2 StLAC2 基因的全长DNA 和cDNA 的克隆与分析
• 3.3.3 StLAC2 基因及其编码产物的生物信息学分析
• 3.3.4 玉米大斑病菌漆酶相似性的聚类分析及保守结构域的鉴定
• 3.4 STLAC2 基因的拷贝数分析
• 3.4.1 探针的制备
• 3.4.2 基因组DNA 酶切效果检测
• 3.4.3 StLAC2 基因的拷贝数分析
• 4 讨论
• 4.1 漆酶活性分析
• 4.2 STLAC1 基因的功能
• 4.3 漆酶基因家族
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢