牦牛金属硫蛋白（MTs）-Ⅲ/-Ⅳ分子特性及MT-Ⅲ表达研究

论文摘要

牦牛（Bos grunniens）是生存于青藏高原的特有物种,对低氧、强紫外线的高原环境具有很强的适应性,可能形成了保护中枢神经系统免受低氧损伤与氧化损伤的特殊机制。金属硫蛋白（MTs）是一类低分子量、高半胱氨酸含量和富含金属的细胞质蛋白,具有重金属解毒,清除自由基,保护脑细胞免受缺血缺氧性脑损伤,以及促进多种脑病理损伤修复等作用。推测金属硫蛋白可能对牦牛适应低氧、强紫外线的高原环境发挥了重要作用,具有相应的分子遗传基础,然而牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ基因的研究尚未见报道。本论文采用RT-PCR、5’RACE等基因克隆技术首次克隆了牦牛MT-Ⅲ转录区序列和MT-Ⅳ基因序列,采用生物信息学方法对牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ蛋白质性质和结构进行了预测,并构建了MT-Ⅲ原核表达体系,主要获得以下结论:1、牦牛MT-Ⅲ基因转录区序列全长1484bp（GenBank Accession No.:DQ492300和EU653285）,5’非翻译区、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3和3’侧翼区长度依次为56bp、31bp、232bp、66bp、817bp、110bp和172bp。2、牦牛MT-Ⅲ基因编码区长207bp,编码68个氨基酸,其中Cys占27.9%,不含芳香簇氨基酸。与MT-Ⅰ和MT-Ⅱ相比,在N端第四个氨基酸后插入一个苏氨酸,在C端插入了GEGAEA序列。牦牛MT-Ⅲ蛋白质分子量6.94KDa,没有明显的疏水区,没有跨膜结构域,不存在信号肽,是一种细胞内蛋白质。3、与人和鼠相比,牦牛MT-Ⅲ基因编码区第88位的碱基T突变成A,使氨基酸序列中第30位保守的Cys被Ser代替,这可能对牦牛MT-Ⅲ的结构和功能产生一定的影响,有待深入研究。4、牦牛MT-Ⅳ基因三个外显子和内含子全长2099bp（GenBank Accession No.:EU665491）,三个外显子长度分别为31bp、66bp和92bp,二个内含子长度分别为1392bp和518bp。编码区长189bp,编码62个氨基酸,其中Cys 20个,不含芳香簇氨基酸。与MT-Ⅰ和MT-Ⅱ相比,在N端第四个氨基酸后插入了一个谷氨酸。MT-Ⅳ蛋白质分子量6.25KDa,没有明显的疏水区,没有跨膜结构域,不存在信号肽,是一种细胞内蛋白质。5、研究表明MT-ⅣmRNA在不存在复层扁平鳞状上皮细胞的器官肝脏、脾脏、脑和脑垂体中也有表达,表明MT-Ⅳ可能不仅限于在复层扁平鳞状上皮细胞中表达,这有待于深入研究。6、牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ编码区序列和氨基酸序列与其它哺乳动物的高度同源,在进化上高度保守,建立的系统进化树与比较形态学和生理学分类结果一致。但非编码区序列同源性很低,这些序列可能存在物种特异性。7、以鼠MT-Ⅲ三级结构为模板,预测出了牦牛MT-Ⅲα结构域的三级结构,表明牦牛MT-Ⅲ蛋白质在第43-46氨基酸间形成α螺旋;以兔MT-Ⅱ三级结构为模板,预测出了牦牛MT-Ⅳ三级结构,MT-Ⅳ没有规则的二级结构,与其它MTs来型不同,MT-Ⅳ两个结构域连接序列为RKS。8、采用pET-42a（+）表达载体,BamH I、XHoI酶切,构建了pET-42a（+）-MT-Ⅲ融合表达重组质粒,转化E.Coli BL21（DE3）plysS表达菌,建立了IPTG诱导表达MT-Ⅲ原核表达体系。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 MT命名与分类
• 1.1.1 MT超家族的定义和分类
• 1.1.2 MT分类描述
• 1.1.3 哺乳动物MT的分类
• 1.2 金属硫蛋白结构
• 1.2.1 MTs一级结构特点
• 1.2.2 MTs的高级结构
• 1.2.3 哺乳动物MTs的生物学特性
• 1.3 金属硫蛋白功能
• 1.3.1 重金属解毒
• 1.3.2 清除自由基与抗氧化应激
• 1.3.3 MTs抗衰老与神经退行性疾病的作用
• 1.3.4 MT-Ⅲ对中枢神经损伤的保护
• 1.3.5 内源性MT-Ⅰ和MT-Ⅱ对CNS的作用
• 1.3.6 外源性MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的作用
• 1.3.7 MT-Ⅰ和MT-Ⅱ作用的分子机理
• 1.3.8 MT-Ⅲ对CNS的保护作用
• 1.4 金属硫蛋白基因的分子生物学特性
• 1.4.1 哺乳动物MTs基因的结构
• 1.4.2 哺乳动物基因的表达调控
• 1.5 哺乳动物MTs在中枢神经系统中的分布
• 1.5.1 MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大脑中的表达
• 1.5.2 细胞内MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的分布
• 1.5.3 MT-Ⅲ的分布
• 1.6 金属硫蛋白及其基因应用
• 1.6.1 MT启动子转基因的应用
• 1.6.2 MT结构基因的应用
• 2 立题依据
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 动物组织样品
• 3.1.2 主要试剂及来源
• 3.1.3 质粒和菌珠
• 3.1.4 试验用溶液配制
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 组织总RNA提取
• 3.2.3 MT-Ⅲ/-Ⅳ RT-PCR反应
• 3.2.4 肌肉组织DNA提取方法
• 3.2.5 MT-Ⅲ基因转录区PCR
• 3.2.6 MT-Ⅳ基因内含子PCR
• 3.2.7 5'RACE反应
• 3.2.8 PCR产物纯化和凝胶回收方法
• 3.2.9 基因克隆方法
• 3.3 MT-Ⅲ基因表达方法
• 3.3.1 表达基因的制备
• 3.3.2 表达载体的制备
• 3.4 生物信息学分析方法
• 3.4.1 核苷酸序列和氨基酸序列相似性分析
• 3.4.2 多序列比对
• 3.4.3 核苷酸序列基本特征分析
• 3.4.4 氨基酸序列基本特征分析
• 3.4.5 信号肽分析
• 3.4.6 蛋白质结构分析
• 3.4.7 核苷酸序列和氨基酸序列进化分析
• 3.4.8 外显子预测
• 4 结果与分析
• 4.1 组织RNA提取
• 4.2 组织基因组DNA提取结果
• 4.3 MT-Ⅲ基因克隆与生物信息学分析
• 4.3.1 RT-PCR
• 4.3.2 PCR产物克隆及测序
• 4.3.3 测序结果及核苷酸特征
• 4.3.4 MT-Ⅲ CDS序列同源性分析
• 4.3.5 MT-Ⅲ基因内含子克隆与序列测定
• 4.3.6 MT-Ⅲ5'和3'RACE结果
• 4.3.7 MT-Ⅲ氨酸基序列同源性及分子进化分析
• 4.3.8 MT-Ⅲ蛋白质特征
• 4.4 MT-Ⅳ CDS克隆与生物信息学分析
• 4.4.1 RT-PCR
• 4.4.2 不同组织器官MT-Ⅳ基因克隆
• 4.4.3 MT-Ⅳ内含子的扩增
• 4.4.4 MT—Ⅳ基因编码区基本特征
• 4.4.5 MT—Ⅳ基因编码区同源性分析
• 4.4.6 牦牛MT-Ⅳ氨基酸序列同源性及分子进化分析
• 4.4.7 牦牛MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ氨基酸序列比较
• 4.4.8 牦牛MT-Ⅳ蛋白质特征
• 4.5 MT-Ⅲ原核表达
• 4.5.1 RT-PCR产物电泳结果
• 4.5.2 重组质粒的酶切鉴定
• 4.5.3 表达载体PET-42a（+）的制备与构建
• 4.5.4 PET-42a-MT-Ⅲ质粒转化及诱导表达结果
• 5 讨论
• 5.1 样品采集对RNA提取的影响
• 5.2 牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ基因核苷酸序列
• 5.3 牦牛MT-Ⅲ和MT-Ⅳ生物信息学分析
• 5.4 MT-Ⅲ和MT-Ⅳ氨基酸序列的系统进化
• 5.5 牦牛MT-Ⅲ基因突变位点分析
• 5.6 牦牛MTs序列间的比较
• 5.7 牦牛MT-Ⅳ分布
• 5.8 牦牛MT-Ⅲ表达载体的选择
• 5.9 表达宿主菌的选择
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 导师简介