基于液质联用的代谢组学在中药复方疗效和安全性评价中的应用

论文摘要

代谢组学,包括基于无歧视分析的发现代谢组学和基于目标化合物定量的靶向代谢组学,两种研究模式各有所长,相互补充,在临床疾病诊断、药物毒理研究等领域有着广泛的应用前景。本论文旨在发展基于液相色谱-质谱联用技术的代谢组学分析方法并探讨其在中药、疾病等复杂体系研究中的应用前景。基于UPLC/TOF-MS技术,采用化学物质组学的研究方法,利用ISO诱导的和冠脉结扎诱导的两种大鼠急性心肌缺血损伤的模型,首先验证了双龙方原方药材配伍的合理性和必要性,然后筛选得到了双龙方有效组分的最佳配伍（双龙新方）,最后还对双龙新方制剂NSLF6的有效性进行了评价。代谢组学结合生理学指标结果揭示了双龙方治疗心肌梗死和心肌缺血的多途径作用机理：双龙方可通过减少细胞凋亡和促进心肌小血管增生来改善缺血和梗死部位血流,从而加快了心脏的恢复和重建；并通过影响柠檬酸循环来提高调整心肌梗死状态下机体的能量代谢水平,降低糖酵解产物对心肌的伤害,改善了心肌的缺血和梗死状态。采用UPLC/TOF-MS代谢组学方法研究了蟾酥对大鼠潜在的心脏急性毒性。结果表明蟾酥毒性对体内代谢的干扰主要集中于脂质代谢的相关途径,从代谢层面上反映了蟾酥导致的心脏损伤,以及该损伤对机体代谢的影响。从配伍的角度发现：复方麝香保心丸能够消除或减弱蟾酥的毒性作用,体现了复方的配伍减毒作用。代谢组学研究与心电图分析结果具有较好相关性。本研究为蟾酥毒性作用机制和临床合理用药提供了参考。采用LC/MS/MS技术,建立了定量叶酸、同形半胱氨酸和谷胱甘肽三大代谢循环圈中16种主要节点代谢物的靶标代谢指纹谱方法平台,并将该平台应用于神经管畸形孕妇血清的分析中。数据经生物学统计分析,找到了与胚胎神经管发育缺陷相关的7种潜在的生物标志物,更新了对神经管畸形发病机理的认识。同时,采用ROC曲线评价7中潜在生物标志物在临床诊断中的准确性,结果发现5-甲基四氢叶酸作为标志物的诊断效果最佳,有可能成为临床诊断的重要指标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 代谢组学简介
• 1.1.1 代谢组学的定义
• 1.1.2 代谢组学在系统生物学研究中的作用
• 1.1.3 代谢组学的优势和不足
• 1.2 代谢组学的发展趋势
• 1.2.1 多样品分析
• 1.2.2 检测技术合并
• 1.2.3 数据合并
• 1.3 代谢组学与中药复方研究的融合
• 1.3.1 代谢组学在中药复方研究的可行性
• 1.3.2 代谢组学在中药复方研究中的应用
• 1.4 代谢组学应用于中药复方研究的发展趋势
• 1.5 本论文的主要内容
• 第2章 治疗心肌梗死中药复方双龙方药材配伍的代谢组学研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 动物实验
• 2.2.4 数据处理
• 2.3 生理学指标分析结果
• 2.3.1 双龙方对血清酶学的影响
• 2.3.2 双龙方对心肌梗死面积的影响
• 2.3.3 双龙方对大鼠心肌病理层面的影响
• 2.4 代谢组学分析结果
• 2.4.1 代谢指纹谱的建立
• 2.4.2 PCA分析
• 2.4.3 PLS-DA分析
• 2.4.4 潜在生物标志物的鉴定
• 2.4.5 潜在生物标志物的生物学意义
• 2.5 本章小结
• 第3章 双龙方有效组分配伍（双龙新方）筛选的代谢组学研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 动物实验
• 3.2.4 样本制备
• 3.2.5 UPLC/TOF-MS测定
• 3.2.6 数据处理
• 3.3 生理学指标分析结果
• 3.3.1 对急性心肌缺血大鼠心电图的影响
• 3.3.2 对血清酶学的影响
• 3.4 代谢组学分析结果
• 3.4.1 代谢指纹谱方法学考察
• 3.4.2 TGS+TSA有效部位组样品PLS-DA聚类比较
• 3.4.3 潜在生物标志物的鉴定
• 3.4.4 潜在生物标志物生物学意义
• 3.5 本章小结
• 第4章 基于双龙新方复方制剂的代谢组学及药效物质基础研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 实验动物及模型的制备
• 4.2.4 实验分组及给药
• 4.2.5 样品收集
• 4.2.6 实验方法
• 4.2.7 数据处理
• 4.3 生理学指标结果分析
• 4.3.1 NSLF6对冠脉结扎大鼠血清酶学的影响
• 4.3.2 NSLF6对冠脉结扎大鼠心脏冠脉心肌梗死面积的影响
• 4.3.3 NSLF6对冠脉结扎大鼠心脏冠脉心肌病理层面的影响
• 4.3.4 NSLF6对梗死边缘区心肌血管面密度的影响
• 4.4 代谢组学分析结果
• 4.4.1 方法学考察
• 4.4.2 NSLF6对冠脉结扎大鼠尿样代谢的影响
• 4.4.3 潜在生物标志物的鉴定及相关代谢途径的研究
• 4.5 NSLF6有效组分的体内变化过程研究
• 4.5.1 材料与试剂
• 4.5.2 仪器设备
• 4.5.3 实验方法
• 4.5.4 样品前处理
• 4.5.5 UPLC/TOF-MS测定
• 4.5.6 数据处理
• 4.6 结果和讨论
• 4.6.1 NSLF6化学组成
• 4.6.2 NSLF6有效部分在大鼠体内的变化情况
• 4.7 本章小结
• 第5章 蟾酥毒理的代谢组学研究及其复方的配伍减毒机制研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 材料与试剂
• 5.2.2 仪器设备
• 5.2.3 实验设计
• 5.2.4 UPLC/TOF-MS分析
• 5.2.5 数据处理
• 5.3 心电图测量结果
• 5.3.1 心率
• 5.3.2 P-R间期
• 5.4 代谢组学结果分析
• 5.4.1 大鼠血清UPLC/TOF-MS代谢指纹谱的建立
• 5.4.2 给药组和对照组代谢指纹谱差异
• 5.4.3 潜在生物标志物的鉴定
• 5.4.4 潜在生物标志物生物学意义
• 5.5 本章小结
• 第6章 基于靶向代谢组学的神经管畸形发生机理的研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验设计
• 6.2.2 材料与试剂
• 6.2.3 仪器设备
• 6.2.4 血清样品前处理
• 6.2.5 HPLC-MS/MS检测
• 6.2.6 标准溶液的配置和标准曲线制备
• 6.2.7 方法学考察
• 6.2.8 数据分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 样品制备方法优化
• 6.3.2 色谱和质谱方法优化
• 6.3.3 标准曲线和检出限
• 6.3.4 方法精密度和回收率
• 6.3.5 临床指标分析
• 6.3.6 组间t检验和协方差分析结果
• 6.3.7 Logistic回归分析
• 6.3.8 潜在生物标志物用于临床诊断准确性的评价
• 6.3.9 神经管畸形发病机理探讨
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录:本人在学期间已发表和待发表的论文