甘农2号和甘农3号苜蓿再生体系的建立及抗旱耐盐基因转化的研究

论文摘要

土壤盐渍化是影响植物生长和产量的环境因子。紫花苜蓿为生长面积最大,利用价值最高的优质牧草。利用转基因技术培养苜蓿抗旱耐盐新品种是目前牧草育种中最有效的手段。本研究拟利用农杆菌介导法,将抗旱基因转入苜蓿中,以提高其抗旱耐盐性。本文通过对2个苜蓿育成品种（甘农2号、甘农3号）再生能力的比较,筛选出较为高效的再生体系品种。利用根癌农杆菌介导法对其进行了抗旱基因的遗传转化的研究,得到了Kan抗性植株。主要研究内容:1.再生体系的建立。本实验中,甘农2号和3号最佳外植体是下胚轴。对于甘农2号,3 mg/L 2,4-D +1.5mg/L NAA为其愈伤组织诱导阶段最佳激素组合,2,4-D作用时间15天为宜;最佳的芽分化培养基为MS+0.5 mg/L KT+0.1mg/L NAA+7g/L琼脂+20g/L蔗糖。甘农3号愈伤组织诱导阶段最佳培养基为MS+ 2,4-D（2.0mg/L）+NAA（1.0mg/L）+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;最佳的芽分化培养基为MS+NAA（0.3 mg/L）+KT（0.5mg/L）+蔗糖20g/L+琼脂7g/L。经比较甘农3号的再生能力优于甘农2号。2.遗传转化体系的建立。以培养7天的甘农3号紫花苜蓿的无菌苗下胚轴为外植体,以农杆菌菌株为介体,优化的基因转化体系如下:Kan筛选浓度定为20mg/L,选择方法为后期选择;抑菌剂选取羧苄青霉素为宜,愈伤诱导阶段浓度为300mg/L,体胚形成及芽诱导分化阶段浓度为200mg/L;用于转化的侵染时间为10 min,菌液浓度OD600=0.3～0.5,外植体预培养时间为3d,与农杆菌共培养3d,乙酰丁香酮浓度为20 mg/L有利于转化。经筛选,得到23株抗Kan的甘农3号转化植株。其中4株经PCR检测,均表现为假阳性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 植物耐盐性及抗旱耐盐基因工程
• 1.1 植物的耐盐机制
• 1.2 盐胁迫下植物体内的生理生化反应
• 1.2.1 盐胁迫对光合作用的影响
• 1.2.2 盐胁迫对细胞膜透性的影响
• 1.2.3 盐胁迫对激素的影响
• 1.2.4 盐胁迫对植物体内矿质养分吸收的影响
• 1.2.5 盐胁迫对有机渗透调节物质的影响
• 1.2.6 盐胁迫对细胞内保护酶类活性的影响
• 2 苜蓿基因工程的应用
• 2.1 苜蓿组组织培养及再生植株
• 2.1.1 基因型的选择
• 2.1.2 外植体的选择
• 2.1.3 培养基的选择
• 2.1.4 激素配比
• 2.1.5 目前存在问题及发展趋势
• 2.2 苜蓿转基因常用的方法
• 2.2.1 农杆菌介导法
• 2.2.2 直接转化法
• 2.3 苜蓿基因工程研究进展
• 2.3.1 苜蓿抗盐转基因
• 2.3.2 苜蓿抗寒抗旱转基因
• 2.3.3 苜蓿抗虫性基因
• 2.3.4 苜蓿抗病毒基因
• 2.3.5 苜蓿抗除草剂基因的研究
• 2.3.6 提高苜蓿含硫氨基酸含量的转基因研究
• 2.3.7 提高苜蓿消化率
• 2.3.8 作为植物生物反应器
• 2.3.9 转基因苜蓿生产可食疫苗的研究
• 2.3.10 控制苜蓿体内单宁合成的相关酶基因的研究
• 2.4 苜蓿遗传转化存在的问题
• 2.5 苜蓿耐盐相关基因克隆研究进展
• 2.5.1 与脯氨酸有关的基因
• 2.5.2 与脱落酸（ABA）密切相关的基因
• 2.5.3 与光合作用有关的基因
• 2.5.4 与钙调蛋白有关的基因
• 2.5.5 与信号转导蛋白激酶有关的基因
• 2.5.6 果聚糖及SacB 基因
• 第二章 不同品种苜蓿再生体系的建立
• 1 甘农2 号杂花苜蓿再生体系的建立
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 甘农2 号苜蓿不同部位外植体愈伤组织的诱导
• 1.2.2 愈伤组织的分化培养
• 1.3 讨论
• 1.3.1 不同激素及浓度配比对愈伤组织诱导和分化的影响
• 1.3.2 关于胚状体分化的诱导
• 1.4 小结
• 2 甘农3 号再生体系的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 甘农3 号愈伤组织的诱导
• 2.2.2 甘农3 号芽分化的诱导
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于甘农3 号愈伤组织的诱导
• 2.3.2 关于甘农3 号芽分化的诱导
• 2.4 小结
• 3 两种苜蓿再生能力的比较
• 第三章 农杆菌介导的SACB 基因对紫花苜蓿的转化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒和农杆菌菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 生化试剂
• 1.1.5 农杆菌质粒DNA 提取试剂
• 1.1.6 植物基因组DNA 的提取试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 筛选培养中卡那霉素选择压的确定
• 1.2.2 筛选培养中抗生素种类及其浓度的确定
• 1.2.3 农杆菌介导的基因转化方法
• 1.2.4 转化体系的建立
• 1.2.5 PCR 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 选择培养中卡那霉素选择压的确定
• 2.2 选择培养中抗生素种类及其浓度的确定
• 2.2.1 抗生素对农杆菌增殖的影响
• 2.2.2 抗生素对外植体愈伤组织诱导及芽分化影响
• 2.3 转化体系的建立
• 2.3.1 侵染时间对转化率的影响
• 2.3.2 农杆菌浓度对转化率的影响
• 2.3.3 预培养时间对转化率的影响
• 2.3.4 共培养时间对转化率的影响
• 2.3.5 乙酰丁香酮浓度对转化率的影响
• 2.3.6 PCR 分子签定
• 3 讨论
• 3.1 抗生素的选择
• 3.2 关于转化体的选择
• 3.3 农杆菌菌株对转化的影响
• 3.4 侵染时间、菌液浓度及共培养时间对转化的影响
• 3.5 关于PCR 检测
• 4 小结
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 作者简介
• 导师简介