论文题目: Maspin基因表达调控的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 贺美兰
导师: 张建业
关键词: 基因,启动区,表达调控,雄激素反应元件,元件,乳香脂,元件结合活性
文献来源: 山东大学
发表年度: 2005
论文摘要: 前列腺癌是威胁男性生命的主要疾病之一,关于其侵袭和转移的分子机制需要更深入的研究。Maspin是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员,在前列腺癌的侵袭与转移中起着非常重要的作用。Maspin表达于正常的哺乳动物上皮细胞中,在原发性前列腺癌细胞中表达下降,在转移性前列腺癌中表达缺失。对maspin基因功能的研究表明:Maspin在体外可以抑制人前列腺癌细胞的侵袭和移动,体内可以抑制裸鼠前列腺癌细胞的生长与转移。而且,Maspin是一有效的血管生成的抑制剂。把前列腺癌细胞LNCaP植入裸鼠的皮下,再用外源性的重组Maspin治疗裸鼠,发现Maspin可以抑制肿瘤细胞的生长和血管的生成。Maspin不仅在侵袭和转移水平抑制前列腺癌的发展,还可以增强肿瘤细胞的凋亡。无论是体外还是体内,内皮细胞中maspin基因的过表达都可以诱导内皮细胞的凋亡,其诱导作用可以被Caspase的抑制剂阻断。Maspin的表达谱及其生物学功能都说明,Maspin可以发展成为一种有效的治疗前列腺肿瘤的靶点。因此,我们有必要在前列腺癌细胞中研究maspin基因的表达调控。 Maspin基因定位于人染色体18q21.3,编码约3.0kb的mRNA转录体,然后翻译成42kDa的蛋白质。Maspin主要存在于多种器官的上皮细胞的细胞膜和细胞质中,细胞核中也有一定的表达。Maspin的cDNA是从正常人的上皮细胞中分离获得,包括2584个核苷酸。对正常细胞和肿瘤细胞中maspin基因的序列分析发现:在肿瘤细胞中maspin基因的序列和结构并没有改变,推测maspin基因在肿瘤细胞中表达下降或缺失并不是基因突变引起的。本研究中我们克隆了含有(-764～+83)的847bp的maspin启动子的报告基因载体,并利用核酸缺失突变技术,报告基因分析和电泳迁移率改变分析(EMSA),在maspin基因启动区鉴定了影响其表达的两个
论文目录:
中文摘要
英文摘要
符号说明
前言
第一部分 人maspin基因启动子的克隆及活性测定
材料
试剂
主要仪器
方法
人基因组DNA的提取
Maspin基因5′上游847bp启动子片段的PCR扩增及纯化
847bp启动子片段的T-载体亚克隆
荧光素酶报道基因载体pGL3-847质粒的构建
细胞的培养
细胞转染实验
荧光素酶活性测定
结果
PCR扩增maspin基因5′上游847bp启动子片段及其T克隆鉴定
pGL_3-847bp启动子质粒的鉴定及测序
pGL_3-847bp启动子转染LNCaP细胞及双荧光素酶活性测定
雄激素类似物R1881在LNCaP细胞中对pGL_3-847bp启动子活性的影响
雄激素及其受体在PC-3M细胞中对pGL_3-847bp启动子活性的影响
讨论
第一部分 总结
第二部分 Maspin基因启动区ARE和Spl元件的鉴定
材料
试剂
主要仪器
方法
荧光素酶报道基因-847bp启动子缺失突变体的构建
细胞培养
细胞转染实验见第一部分
双荧光素酶活性测定见第一部分
核蛋白的制备及浓度测定
电泳迁移率变动分析(eleetrophoretie mobility shift assay，BMSA)
探针的标记
核蛋白结合反应
非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)
化学发光检测
结果
847bp启动子缺失突变体的酶切鉴定
847bp启动子缺失字亦休的姗良J扭
ARE缺失突变体在LNCaP中的启动子活性测定
ARE缺失突变体在PC一3M中的启动子活性测定
Spl缺失突变体在LNCaP细胞中的启动子活性测定
Spl缺失突变体在PC一3M中的启动子活性测定
SPI和ARE元件探针标记效率的检测
AR结合甜sP初启动子中的ARE元件
Maspin启动子中的Spl元件与前列腺癌中的一些蛋白结
讨论
第二部分 总结
第三部分 乳香脂通过抑制AR的功能和增强Spl的结合活性升高maspin基因的表达
材料
试剂
主要仪器
方法
LNCaP细胞的培养及处理
MTT法检测细胞的生长情况
总蛋白的制备和定量
蛋白免疫印迹分析
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白印迹
化学发光试剂盒显色
RT-PCR
RNA的提取及浓度测定
逆转录反应:
PCR反应
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定
细胞转染实验与双荧光素酶活性测定.详细步骤参见第一部分
电泳迁移率结合分析，详细步骤参见第二部分
结果
乳香脂抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP的生长。
乳香脂在蛋白表达水平升高朋sP初基因的表达
乳香脂在转录水平升高，sP初基因的表达
乳香脂增强朋sPz’n基因847bp启动子的活性
乳香脂抑制细胞核中AR的表达
乳香脂抑制朋sPz’n启动子中ARE的结合活性
乳香脂增强诩sPz’n启动子中Spl元件的结合活性
讨论
参考文献
博士在读期间发表的论文目录
致谢
附图
发布时间: 2005-10-17
参考文献
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