鸡白介素18在原核和真核中的表达与生物学活性的检测

论文摘要

白细胞介素18是一种新发现的细胞因子,具有多种生物学功能,能够促进γ干扰素（IFN-γ）的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方而具有重要的作用。同时,白细胞介素18在作为天然的免疫调节剂,在集约化畜禽养殖业中,是一种可以替代传统疗法的新型免疫调节剂,具有巨大的应用前景。目前国内外对IL-18的研究主要集中在人和鼠等哺乳动物,而对鸡IL-18的研究报道不多,为此,本试验应用已成功开发使用的原核大肠杆菌表达体系及酵母表达系统对鸡IL-18进行了表达,并对其表达产物的生物学活性分别进行了分析,为进一步研究鸡IL-18的作用机理及其在鸡体内的生物学功能奠定了基础。第一部分:鸡IL-18在大肠杆菌BL21-ChIL-18中的表达、纯化及体外生物活性检测首先对重组菌BL21-ChIL-18的遗传稳定性进行了分析,筛选出了其最佳诱导表达条件,然后用Sephadex G-100对目的蛋白进行纯化,并以牛血清白蛋白为标准蛋白质,用Bradford法检测了纯化的目的蛋白的浓度,对其进行了定量。最后分别用Western bloting、MTT和ELISA等方法在体外分析了其生物学活性。结果表明该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18,在诱导温度37℃时,IPTG浓度为0.6 mmol/L时,诱导4 h目的蛋白相对表达量最高。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡白介素18具有刺激淋巴细胞转化和诱导其分泌γ干扰素的活性。第二部分:鸡IL-18在真核毕赤酵母的表达、纯化和体外生物学活性检测首先应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33中,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达。表达产物用Western bloting鉴定正确后,对其遗传稳定性进行分析,并对其表达条件进行优化,然后再其最佳诱导条件下对重组工程菌进行大量诱导表达并用Sephadex G-100对目的蛋白进行纯化,并用Bradford法检测纯化目的蛋白的浓度,对其进行定量,最后分别用MTT和ELISA等方法在体外对其生物学活性进行分析。结果,成功构建了鸡IL-18真核酵母表达载体,且该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18。其在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度为26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡白介素18具有刺激淋巴细胞转化和诱导淋巴细胞分泌r干扰素的活性。第三部分:重组鸡IL-18对新城疫疫苗免疫免疫效果的影响0日龄300只鸡随机分为6组,每组50只鸡,即空白对照组,新城疫疫苗组,新城疫疫苗+原核IL-18组,新城疫疫苗+原核空载体对照组,新城疫疫苗+真核IL-18组,新城疫疫苗+真核空载体对照组。所有免疫组均于8日龄分别免疫接种相应疫苗,并分别于免疫后的第3 d,7 d,14 d,21 d,28 d和35 d各组鸡随即抽取4只,对其血清的抗体效价、γ干扰素含量、外周血的T淋巴细胞转化水平及其NO分泌和免疫器官指数进行测定,18天后各组随机取20只鸡用于动物攻毒保护试验,。结果表明重组鸡IL-18蛋白增强了新城疫疫苗的免疫效果,提高了血清中抗体水平和γ干扰素含量、提高了T淋巴细胞的转化水平和巨噬细胞分泌NO的水平,促进了鸡免疫器官的生长发育和成熟,升高了其各免疫器官指数,且部分指标差异达到显著（0.01﹤P﹤0.05）或极显著水平（P<0.01）。综上所述,本研究成功的在原核细胞大肠杆菌BL21及真核细胞毕赤酵母X-33中分别表达了鸡IL-18,表达量均较高,且纯化后都具有生物学活性,对新城疫疫苗都有免疫增强作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 鸡白介素18 的研究进展
• 1.1.1 细胞因子简介
• 1.1.2 Il-18 简介
• 1.2 大肠杆菌表达系统
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统简介
• 1.2.2 大肠杆菌表达系统的组成
• 1.2.3 pET 表达系统简介
• 1.2.4 影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素
• 1.3 酵母表达系统简介
• 1.3.1 宿主菌
• 1.3.2 表达载体
• 1.3.3 毕赤酵母表达系统的特点
• 1.3.4 影响外源基因表达的因素
• 1.3.5 宿主菌的甲醇利用表型（Mut+和Muts）
• 1.3.6 信号肽
• 1.3.7 基因剂量
• 1.3.8 环境因素
• 第二章 鸡白介素18 在大肠杆菌中的表达优化、纯化及体外活性检测
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、载体及抗体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂的配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 ChIL-18 蛋白的诱导表达及SDS-PAGE
• 2.2.2 Western blotting 分析
• 2.2.3 重组菌的遗传稳定性分析
• 2.2.4 重组菌表达条件的优化
• 2.2.5 重组ChIL-18 蛋白的纯化和定量
• 2.2.6 重组ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞增殖试验
• 2.2.7 重组ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞分泌γ干扰素试验
• 2.3 试验结果与分析
• 2.3.1 重组ChIL-18 蛋白的诱导表达和Western blotting 分析
• 2.3.2 重组菌的遗传稳定性分析
• 2.3.3 重组菌表达条件的优化
• 2.3.4 重组ChIL-18 蛋白的纯化
• 2.3.5 重组ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞转化试验
• 2.3.6 分泌γ干扰素试验
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 鸡IL-18 在酵母中的表达、纯化与体外活性检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 载体、菌株及抗体
• 3.1.2 主要酶和试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂的配置
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 重组质粒pMD18-T-ChIL-18 的扩增与提取
• 3.2.3 ChIL-18 基因序列的制备
• 3.2.4 质粒pPICZαA 的大量提取及纯化
• 3.2.5 ChIL-18PCR 扩增产物和质粒pPICZαA 的双酶切及酶切产物的纯化
• 3.2.6 连接反应
• 3.2.7 连接产物原核宿主菌JM109 感受态细胞的转化
• 3.2.8 重组质粒的鉴定
• 3.2.9 重组质粒pPICZαA-ChIL-18/pPICZαA 大量提取及线性化
• 3.2.10 酵母菌X-33 感受态细胞的制备
• 3.2.11 电脉冲转化毕赤酵母
• 3.2.12 高抗性阳性转化子的筛选
• 3.2.13 阳性转化子的筛选
• 3.2.14 重组酵母菌的诱导表达
• 3.2.15 表达产物的Western blotting 分析
• 3.2.16 重组酵母菌的遗传稳定性试验
• 3.2.17 重组菌表达条件的优化
• 3.2.18 重组ChIL-18 蛋白的纯化和定量
• 3.2.19 重组ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞转化试验
• 3.2.20 ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞分泌γ干扰素试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 ChIL-18 基因序列的制备
• 3.3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3.3 电转化及重组酵母菌的鉴定
• 3.3.4 重组菌的诱导表达及Western bloting 分析
• 3.3.5 IL-18 的重组表达载体在酵母中的遗传稳定性试验
• 3.3.6 重组毕赤酵母菌表达条件的优化
• 3.3.7 重组鸡IL-18 的纯化
• 3.3.8 重组ChIL-18 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞转化试验
• 3.3.9 分泌γ干扰素试验
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 重组鸡IL-18 对新城疫疫苗免疫增强作用的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 疫苗和毒株
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.1.5 主要试剂配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 0.5%鸡红细胞悬液的制备
• 4.2.2 抗原效价的检测
• 4.2.3 血清抗体效价的检测
• 4.2.4 试验鸡的分组及免疫
• 4.2.5 血清中抗体效价的测定
• 4.2.6 外周血T 淋巴细胞增值试验
• 4.2.7 巨噬细胞分泌NO 的测定
• 4.2.8 血清中干扰素含量的测定
• 4.2.9 试验鸡免疫指数的测定
• 4.2.10 攻毒试验
• 4.2.11 数据分析
• 4.3 试验结果与分析
• 4.3.1 血清中抗体效价的测定结果
• 4.3.2 外周血T 淋巴细胞增殖试验
• 4.3.3 巨噬细胞分泌NO 的测定
• 4.3.4 血清中γ干扰素含量的测定
• 4.3.5 试验鸡免疫器官指数的测定
• 4.3.6 攻毒试验
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介