硫素对不同大豆品种AM真菌侵染影响及菌群结构分析

论文摘要

大豆是中国第四大粮食作物和重要的油料作物。目前,如何提高大豆产量和质量是中国大豆产业面临的重大难题。硫元素是继氮、磷、钾之后大豆必需的第四大营养元素,硫元素在大豆生长、发育及代谢过程中具有重要的生理功能,而我国土壤中普遍存在严重缺硫的现象。AM真菌在大豆的生长发育过程中起着至关重要的作用,对于其能否提高大豆对土壤中硫素的利用率以及土壤中的硫素对大豆形成丛枝菌根的过程是否有影响等问题,目前在国内外还鲜见报道。本项研究采用传统形态学与PCR-DGGE技术相结合的方法研究硫素对不同大豆品种AM真菌菌群结构的影响,为研究硫素如何影响大豆与AM真菌之间形成高效共生体,获得较高的大豆产量和改善大豆品质提供理论依据。1.采用碱解离-酸性品红染色法对不同大豆品种生育期内AM真菌侵染率测定表明：硫素对大豆AM真菌的侵染率有影响,同一品种不同处理、同一处理不同品种、不同品种不同处理相比较得出大豆AM真菌侵染率差异显著,说明硫素和品种二个因素对大豆AM真菌的侵染存在交互作用。2.通过统计AM真菌侵染率可知：生育期内黑农37、黑农44均以S2处理侵染率最高；黑农48出苗后30d和80d,以S2侵染率最高,出苗后120d,以S3处理侵染率最高；在同一硫处理下,黑农37、黑农44和黑农48三个大豆品种的AM真菌的侵染率均是在第80d时最高,且同一处理不同品种间的侵染率不同,以高蛋白品种AM真菌侵染能力最强。3.经多次试验,最终确定大豆AM真菌最佳DGGE条件为：丙烯酰胺浓度8.0%,凝胶变性梯度范围40%-70%,纯化后的PCR产物作为DGGE上样样品,电泳温度60℃；电泳电压130V,电泳时间9h。4.根据DGGE条带的共有性和特异性,选择21条DGGE条带进行测序,结果表明,21个序列与不可培养的球囊霉属AM真菌具有较高的相似性,说明大豆根系和土壤中AM真菌的主要优势菌群为球囊霉属,其中包括摩西球囊霉（Glomus mosseae）、粘性球囊霉（Glomus viscosum）和其它的一些未知的球囊霉属AM真菌。除AM真菌之外,在21条条带中发现有裸子囊霉属真菌以及与肉盘菌科（Sarcosomataceae）相似性达94%的菌群,这说明Nested-PCR所选引物的特异性有一定缺陷。5.硫素对不同大豆品种生育期内AM真菌菌群结构有影响。在生育期内,同一品种不同处理、不同品种同一处理、不同品种不同处理3种情况下根系和根际土壤的DGGE图谱的丰度和多样性指数均不同,差异显著,并与侵染率结果相符,且图谱中各样品的最优势种群及优势度最低的种群有变化,说明硫素对不同品种大豆AM真菌菌群结构有影响。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 硫在大豆生长代谢及产量品质中的作用
• 1.1.1 硫素对大豆生长发育的影响
• 1.1.2 硫素对大豆产量和品质的影响
• 1.2 丛枝菌根真菌简介
• 1.2.1 菌根概述
• 1.2.2 丛枝菌根真菌在生态学中的作用
• 1.3 大豆AM真菌与土壤中营养元素关系研究现状
• 1.3.1 大豆AM真菌与磷素之间的关系
• 1.3.2 大豆AM真菌与氮素之间的关系
• 1.3.3 大豆AM真菌与硫素之间的关系
• 1.4 本研究的目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 试验样地
• 2.1.2 大豆品种
• 2.1.3 供试质粒、菌种及扩增引物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 培养基及试剂盒
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 试验设计
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 样品采集及处理
• 2.3.2 大豆菌根形态观察及侵染率分析
• 2.3.3 根系及土壤DNA的提取
• 2.3.4 Nested-PCR
• 2.3.5 PCR产物纯化
• 2.3.6 PCR产物的回收
• 2.3.7 DGGE条件的优化及检测
• 2.3.8 DGGE条带的回收、克隆、测序及序列分析
• 2.4 侵染率的统计及DGGE图谱分析
• 2.4.1 侵染率的统计
• 2.4.2 DGGE图谱分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 菌根形态观察及侵染率测定
• 3.1.1 菌根形态观察
• 3.1.2 侵染率的测定
• 3.2 样品DNA的提取
• 3.3 Nested-PCR
• 3.4 DGGE条件的优化
• 3.4.1 DGGE上样样品的确定
• 3.4.2 凝胶变性梯度范围的确定
• 3.4.4 电泳时间的确定
• 3.5 DGGE图谱
• 3.6 DGGE条带的序列分析
• 3.6.1 DGGE条带的重扩增
• 3.6.2 克隆结果的检测
• 3.6.3 DGGE条带的测序分析
• 3.6.4 系统发育分析
• 3.7 DGGE图谱分析
• 3.7.1 HN37出苗后30 d的DGGE图谱分析
• 3.7.2 HN37出苗后80d的DGGE图谱分析
• 3.7.3 HN37出苗后120d DGGE图谱分析
• 3.7.4 硫素对HN37AM真菌菌群结构的影响
• 3.7.5 HN44出苗后30d的DGGE图谱分析
• 3.7.6 HN44出苗后80d的DGGE图谱分析
• 3.7.7 HN44出苗后120d的DGGE图谱分析
• 3.7.8 硫素对HN44 AM真菌菌群结构的影响
• 3.7.9 HN48出苗后30d的DGGE图谱分析
• 3.7.10 HN48出苗后80d的DGGE图谱分析
• 3.7.11 HN48出苗后120d的DGGE图谱分析
• 3.7.12 硫素对HN48AM真菌菌群结构的影响
• 3.7.13 硫素对品种间AM真菌菌群结构的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 课题背景
• 4.2 土壤理化性质对AM真菌侵染的影响
• 4.3 样品DNA的提取及对DGGE的影响
• 4.4 DGGE的局限性
• 4.4.1 DGGE对PCR条件的限制
• 4.4.2 DGGE条带的不确定
• 4.4.3 DGGE对优势种群的限制
• 4.5 硫素水平对不同大豆品种AM真菌DGGE图谱的影响
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文