冷诱导下柠条锦鸡儿SSH文库的构建

论文摘要

低温是影响植物生长及分布的一个重要生态因子,限制一些对冷敏感的作物在低温季节的种植,导致光合效率低下、作物产量降低。柠条锦鸡儿分布于草原化荒漠和典型荒漠带的固定和半固定沙地上,在低温胁迫下具有很强的保水、吸水能力,适应低温环境。目前,人们对其的研究主要集中在生物学特性、光合特性和水分特性上,但对其分子机理的研究很少。以低温胁迫的柠条锦鸡儿cDNA为试验方（tester）,以正常生长的柠条锦鸡儿cDNA为驱动方（driver）,利用抑制性差减杂交技术构建了柠条锦鸡儿低温诱导表达差减文库,文库扩增后得到1318个阳性克隆,菌落PCR分析,得到250-750 bp插入片段。将整个文库克隆进行测序,测得序列结果利用BLAST与GenBank数据库进行同源序列比对分析,共获得238个Contigs和584个Singlets,合计822个UniESTs。柠条锦鸡儿体内富含多糖,作者改进了RNA的提取方法,使其适用于从柠条锦鸡儿的茎和叶中提取高质量的RNA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物耐低温研究进展
• 1.1.1 低温胁迫对植物细胞膜的影响
• 1.1.2 低温胁迫对植物光合作用的影响
• 1.1.3 低温胁迫对植物内源激素的影响
• 1.1.4 低温胁迫对植物体内渗透调节物质的影响
• 1.1.5 低温胁迫引起的下游信号转导
• 1.2 抑制性差减杂交技术简介
• 1.2.1 SSH 技术的原理
• 1.2.2 SSH 技术的优缺点
• 1.2.3 SSH 技术在植物上的研究进展
• 1.3 SSH 在植物抗寒研究中的应用
• 2 研究目标、研究内容与技术路线
• 2.1 研究意义
• 2.2 研究目标
• 2.3 本实验的研究方法
• 3 一种有效的柠条锦鸡儿总RNA 提取方法的建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂及耗材
• 3.1.3 试剂配制
• 3.2 RNA 的提取方法
• 3.3 RNA 的质量检测
• 3.3.1 电泳检测
• 3.3.2 260／280 和260／230 比值
• 3.3.3 RT-PCR 检测
• 3.4 RNA 提取中去除多糖的研究
• 3.4.1 低浓度乙醇去除多糖污染
• 3.4.2 LiCl 过夜沉淀去除多糖污染
• 3.4.3 高盐法去除多糖污染
• 3.4.4 将低浓度乙醇和醋酸钾两种方法结合去除多糖污染
• 3.5 结果分析
• 3.5.1 RNA 电泳检测
• 3.5.2 260／280 和260／230 比值
• 3.5.3 RT-PCR 检测
• 3.5.4 RNA 提取中多糖去除的摸索性研究结果及分析
• 4 柠条锦鸡儿低温胁迫抑制性差减杂交（SSH）文库的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 植物培养
• 4.1.3 菌种及克隆载体
• 4.1.4 试剂盒
• 4.1.5 实验所用的引物和接头序列
• 4.1.6 试剂
• 4.2 采用QIAGEN MRNA MIDI KIT 分离MRNA
• 4.3 抑制性差减杂交法构建差减文库
• 4.3.1 cDNA 第一链的合成
• 4.3.2 cDNA 第二链合成
• 4.3.3 RsaⅠ消化
• 4.3.4 Adaptor 连接
• 4.3.5 接头连接效率分析
• 4.3.6 第一次杂交
• 4.3.7 第二次杂交
• 4.3.8 PCR 扩增
• 4.3.9 差减文库的克隆
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 双链cDNA 的合成和Rsa I 酶切
• 4.4.2 接头连接效率检测
• 4.4.3 两轮PCR 扩增
• 4.4.4 差减cDNA 片段的克隆和阳性克隆的PCR 鉴定
• 5 EST 生物信息学分析
• 5.1 差减CDNA 文库测序
• 5.2 分析
• 5.2.1 渗透调节物质合成相关基因
• 5.2.2 光合作用相关基因
• 5.2.3 调节基因
• 5.2.4 细胞抗氧化及活性氧清除相关基因
• 5.2.5 其他
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介