猪囊尾蚴10kD基因的克隆、表达及重组蛋白ELISA方法的建立

论文摘要

猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患寄生虫病,不但引起猪肉品质下降,而且给人类健康造成重大危害。目前,猪囊尾蚴病的免疫诊断和免疫预防是国内外学者的关注的热点。本研究通过基因工程方法克隆猪囊尾蚴囊液10kD基因,构建重组表达载体,得到高效表达;利用镍亲和层析方法纯化高效表达蛋白;利用蛋白建立间接ELISA方法来检测猪囊尾蚴病抗体。为猪囊尾蚴病检测试纸条、试剂盒的研制提供重要参考依据。1、利用PCR技术对猪囊尾蚴囊液10kD基因进行扩增,得到258bp的基因片断。将10kD基因克隆入表达载体pET32a中,构建载体PET32a-TS10-1;经过PCR扩增和双酶切鉴定及测序分析,证明该基因正确插入到克隆载体中,且阅读框正确;序列分析证明该基因与排泄分泌抗原B抗原基因同源性为100%,从而证明该基因与排泄分泌抗原之间存在较近的亲缘关系。重组的pET32a-TS10-1质粒转化至BL21（DE3）宿主菌中;经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达后,在SDS-PAGE鉴定中可见表达产物分子质量约为29kD,与理论推测蛋白分子量一致;经Western blot证明该表达蛋白可以被兔抗囊尾蚴囊液多抗血清特异性识别,该表达蛋白可作为基因工程诊断抗原。2、经过收集诱导表达菌体、超声波裂解后,证明该蛋白属于可溶性表达;通过经过镍鳌合层析柱对于该蛋白进行纯化。通过改变咪唑浓度﹑调整流速、作用温度等极大地提高了纯化蛋白的纯度和回收量;在Western blot试验中,不需经过酶切的可溶性蛋白可与兔抗囊尾蚴多抗血清表现特异性结合,说明融合蛋白具有较好的反应性,为囊尾蚴病快速诊断提供研究基础。3、用纯化的表达蛋白作为包被抗原包被酶标板,初步建立快速检测猪囊尾蚴病的间接ELISA方法。抗原包被浓度为3.145μg?mL-1;抗体稀释度为1:20,37℃作用45min;羊抗猪酶标二抗稀释度为1:2000,37℃作用45min;底物溶液室温显色10min;经过特异性﹑敏感性试验进一步表明,建立的间接ELISA方法特异性强﹑灵敏度高。为进一步组装诊断试纸条﹑试剂盒奠定了物质基础,也为囊尾蚴病的诊断与检测提供一种简便﹑快捷﹑价格低廉的技术手段。

论文目录

• 致谢
• 缩略词表
• 摘要
• 文献综述
• 综述一 猪带绦虫
• 1. 猪带绦虫的起源
• 2. 猪带绦虫及其幼虫（囊尾蚴）的研究历史
• 3. 猪带绦虫成虫、幼虫（囊尾蚴）及虫卵
• 4. 猪带绦虫生活史
• 5、流行病学
• 6. 症状
• 7. 病变
• 8. 囊尾蚴病的危害
• 综述二 囊尾蚴病免疫预防
• 1. 虫体抗原疫苗
• 2. 合成疫苗
• 3. 结论与讨论
• 综述三 囊尾蚴病诊断研究进展
• 1. 病原学检测
• 2. 抗原检测
• 3. 抗体检测
• 4. 结论与讨论
• 试验一 猪囊尾蚴10kD 基因在大肠杆菌中的克隆及序列分析
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 试验二 猪囊尾蚴10KD 基因编码蛋白在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 试验三 10kD重组蛋白抗体检测方法的初步建立
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 参考文献
• Abstract