PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达与鉴定

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种急性传染病,对养猪业的危害极大。我们的前期研究发现感染了PRRSV的猪血清中有两种不同的抗GP5的自身抗独特型抗体（auto-Ab2）,在针对PRRSV感染的免疫网络中能起到正向或负向调控作用。我们前期制备的针对抗PRRSV GP5抗体的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2）具有结合Marc-145细胞的功能。单链抗体具有免疫原性小,仍保持亲本抗体结合抗原的特异亲和力;而且分子量小,实质组织穿透力强,血浆半衰期短,因此,单链抗体在临床疾病的研究、诊断和治疗方面具有重要的应用价值。为了进一步明确Mab2-5G2结合细胞的功能区域,需要制备只包含抗体可变区片段（Fv）的Mab2-5G2单链抗体（scFv）。本研究从分泌Mab2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以此为模板扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因;根据鼠源抗体基因家族可变区的骨架区（framework region, FR）和互补决定区（complementarity-determining region, CDR）氨基酸序列特点,设计并合成了抗体重、轻链可变区基因的引物;以cDNA为模板扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。以VH-linker-VL的形式通过重叠PCR（overlapping-PCR）扩增出scFv基因,基因序列分析表明:VH和VL通过编码（G4S）3连接肽的45bp基因序列连接在一起构成scFv基因,其全长762bp,VH基因位于linker的上游,长360bp,编码120个氨基酸;VL基因位于linker的下游,长357bp,编码119个氨基酸。将scFv与原核表达载体pEasy-E1连接构建原核重组表达质粒pEasy-scFv。将pEasy-scFv转化受体菌E. coli .BL2（1Rosetta）感受态细胞中,经IPTG诱导成功表达了目的蛋白,表达产物主要以包涵体的形式存在。表达后的蛋白经SDS-PAGE分析,其分子量大约为30KD,与预期大小一致。Ni-resin纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上,分别用鼠源抗His的单抗和兔源抗体Ab3为一抗（经纯化的针对Mab2-5G2可变区的抗体）进行Western-blot分析鉴定,结果表明scFv蛋白具有良好的免疫原性。纯化后的ScFv蛋白用尿素梯度为8mol/L～2 mol/L且PH梯度为6～8.5的复性溶液在16℃条件下进行双梯度透析复性,每个梯度透析12h;复性后的scFv蛋白能够具有天然抗体Mab2-5G2的功能可特异性结合Marc-145细胞。分别用Mab2-5G2、scFv免疫新西兰白兔制备抗血清, Mab2-5G2、scFv蛋白能和彼此的抗血清发生交叉反应。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 发病历史回顾
• 1.2 病原学
• 1.2.1 病原类属
• 1.2.2 病毒结构特点和生物学活性
• 1.2.3 病毒的增殖特性
• 1.3 流行病学
• 1.4 致病机制及临床表现
• 1.4.1 致病机制
• 1.4.2 临床症状
• 1.4.3 剖检病变
• 1.4.4 显微病变
• 1.5 分子生物学
• 1.5.1 病毒基因组结构
• 1.5.2 结构蛋白
• 1.5.3 病毒的异质性
• 1.5.4 病毒的致弱
• 1.5.5 病毒的变异
• 1.6 免疫学
• 1.6.1 免疫机理
• 1.6.2 免疫抑制
• 1.6.3 抗体依赖性增强作用
• 1.6.4 疫苗免疫
• 1.7 免疫网络学说
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试验所用溶液及配制
• 2.2.1 细胞培养用溶液及配制
• 2.2.2 基因克隆与表达用溶液及配制
• 2.2.3 镍柱蛋白纯化所用溶液及配制
• 2.2.4 I-ELISA 用溶液及配制
• 2.2.5 IFA 用溶液及配制
• 2.2.6 腹水制备所用溶液及配制
• 2.2.7 蛋白复性所用溶液及配制
• 2.3 主要设备及仪器
• 2.4 方法
• 2.4.1 细胞的传代及培养
• 2.4.2 抗独特型抗体轻重链可变区基因的克隆测序
• 2.4.2.1 细胞总RNA 的提取
• 2.4.2.2 引物的设计与合成
• 2.4.2.3 抗体轻、重链可变区基因的RT-PCR 扩增
• 2.4.2.4 抗体轻、重链可变区基因的PCR 产物的胶回收与纯化
• 2.4.2.5 抗体轻、重链可变区基因PCR产物与T载体的连接
• 2.4.2.6 氯化钙法制备新鲜的 E.coli 感受态细胞（Top10/ Rosetta）
• 2.4.2.7 PMD-VL、PMD-VH 转化 Top10 感受态细胞
• 2.4.2.8 PMD-VL、PMD-VH 质粒的提取
• 2.4.2.9 PMD-VL、PMD-VH 质粒的PCR 鉴定及测序分析
• 2.4.3 抗独特型单链抗体原核表达质粒的构建及表达
• 2.4.3.1 引物的设计与合成
• 2.4.3.2 抗独特型单链抗体片段的扩增
• 2.4.3.3 抗独特型单链抗体 PCR 产物的连接转化
• 2.4.3.4 抗独特型单链抗体重组质粒的提取
• 2.4.3.5 抗独特型单链抗体重组质粒的鉴定及测序
• 2.4.3.6 抗独特型单链抗体重组蛋白的诱导表达
• 2.4.3.7 抗独特型单链抗体重组蛋白 SDS-PAGE 蛋白质电泳分析
• 2.4.4 抗独特型单链抗体的纯化、复性及鉴定
• 2.4.4.1 抗独特型单链抗体重组蛋白的纯化
• 2.4.4.2 抗独特型单链抗体重组蛋白的复性
• 2.4.5 抗独特型单链抗体的鉴定
• 2.4.5.1 IFA 鉴定复性scFv 蛋白的活性
• 2.4.5.2 Western-blot 鉴定复性scFv 的活性
• 2.4.6 兔源 Mab2-5G2、Mab-HEV 抗体的制备
• 2.4.6.1 Mab2-5G2 和Mab-HEV 腹水的制备
• 2.4.6.2 Mab2-5G2 和Mab-HEV 腹水的纯化
• 2.4.6.3 纯化后 Mab2-5G2 和 Mab-HEV 抗体的鉴定
• 2.4.6.4 兔子的免疫
• 3. 结果与分析
• 3.1 VH和VL基因的克隆测序
• 3.1.1 PCR 扩增可变区基因
• 3.1.2 VH 和VL 基因的胶回收
• 3.1.3 VH 和VL 重组质粒鉴定
• 3.2 scFv 重叠PCR 扩增及其原核重组表达质粒的构建
• 3.2.1 PCR 扩增可变区基因
• 3.2.2 原核重组质粒pEasy-scFv 的构建及鉴定
• 3.3 原核重组质粒pEasy-scFv 的诱导表达
• 3.4 抗独特型单链抗体重组蛋白的纯化、复性及鉴定
• 3.4.1 抗独特型单链抗体重组蛋白的纯化
• 3.4.2 抗独特型单链抗体重组蛋白的复性及鉴定
• 3.4.2.1 重组蛋白scFv 的 Western-blot 分析
• 3.4.2.2 重组蛋白scFv 的 IFA 鉴定
• 3.5 兔源 Mab2-5G2、Mab-HEV 抗体的制备
• 3.5.1 纯化后Mab2-5G2 和Mab-HEV 抗体的SDS-PAGE 鉴定
• 3.5.2 纯化后Mab2-5G2 和Mab-HEV 抗体的IFA 鉴定
• 3.5.3 兔源 Mab2-5G2、scFv 抗体的制备多克隆血清的检测
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 创新之处
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢
• 附件