鸡IL-2cDNA及其去信号肽cDNA的原核和酵母表达研究

论文摘要

白细胞介素2（Interleukin-2,IL-2）主要是由T细胞和NK细胞等产生一种的糖蛋白,在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥着重要的作用。鸡IL-2（ChIL-2） mRNA全长747bp,阅读框cDNA 429bp,编码142个氨基酸残基,N端含有22个氨基酸残基的信号肽序列。本文为探讨ChIL-2全基因和去除信号肽的基因序列在原核和真核表达系统中的表达行为,分别构建含有信号肽序列和不含信号肽序列的原核和酵母表达载体,并在大肠杆菌和酵母中进行表达,以期为IL-2基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。根据GenBank中发表的ChIL-2基因cDNA序列设计三条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429bp的ChIL-2基因全长编码区cDNA和363bp的成熟的ChIL-2的cDNA,分别将两段cDNA克隆到原核表达载体pET28a（+）和酵母表达载体pPICZαA中,获得原核重组质粒pET28a-IL-2、pET28a-△SIL-2和酵母重组质粒pPICZαA-IL-2、pPICZαA-△SIL-2。SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物,RNA Structure软件分析mRNA5′端的二级结构。pET28a-IL-2、pET28a-△SIL-2转化的BL21（DE3）菌在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导4h表达水平最高,表达出的22kD和18kD蛋白经Western blotting鉴定为鸡IL-2和△SIL-2。在相同条件下,IL-2的表达水平明显低于△SIL-2,经RNA Structure软件分析发现,在IL-2 mRNA的5′端形成了比较复杂的二级结构,“茎环”比为1.034,而△SIL-2 mRNA的5′端的“茎环”比仅为0.571。推测可能是由于IL-2 mRNA5′端复杂的二级结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合,从而影响了翻译的起始效率的缘故。pPICZαA-IL-2和pPICZαA-△SIL-2转化的巴斯德毕赤酵母X-33在30℃、甲醇浓度为1%、诱导72h和96h表达明显,表达出28kD和24kD的融合蛋白经Wester-blotting鉴定为鸡IL-2和△SIL-2。在相同条件下,IL-2的表达水平略低于△SIL-2,经RNA Structure软件分析发现,前者的mRNA也形成了比较复杂的二级结构,“茎环”比为1,而后者的mRNA的“茎环”比为0.4706。推测mRNA复杂的二级结构也可能是影响酵母表达水平的原因之一。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一篇 文献综述
• 第一章 白细胞介素2 概况
• 1 IL-2 的分类、结构与功能
• 2 IL-2 受体（IL-2R）
• 3 IL-2 的纯化和突变分析
• 4 白细胞介素2 的生物学功能
• 5 白介素2 基因克隆与表达
• 6 IL-2 在畜禽业中的应用前景
• 6.1 传染性法氏囊病（IBD）是目前危害世界养禽业的两大传染病之一
• 6.2 马立克病（MD）由 B 疱疹病毒引起的、具有高度接触传染性的肿瘤性疾病
• 6.3 IL-2 在其他抗感染免疫中也发挥同样作用
• 第二章 大肠杆菌表达系统
• 1 大肠杆菌表达系统的特点
• 2 表达载体
• 3 外源基因在大肠杆菌中表达效率的影响因素
• 3.1 密码子的选用
• 3.2 外源基因mRNA 的稳定性
• 3.3 翻译起始效率
• 第三章 巴斯德毕赤酵母（ P.pastoris）研究进展
• 1 巴斯德毕赤酵母表达系统概述
• 2 巴斯德毕赤酵母菌株
• 3 巴斯德毕赤酵母表达载体
• 4 基因整合
• 5 影响外源基因表达的因素
• 5.1 启动子的影响
• 5.2 外源基因自身的影响
• 5.3 信号肽
• 5.4 基因剂量
• 5.5 发酵条件
• 第二篇 研究报告
• 第一章 鸡 IL-2 cDNA 及其去信号肽 cDNA的克隆与原核表达
• 1 材料
• 1.1 鸡胚和新城疫疫苗
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 工具酶和主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 目的基因的扩增
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.3 重组克隆质粒的提取与鉴定
• 2.4 重组表达质粒的构建
• 2.5 重组表达质粒的提取与鉴定
• 2.6 重组质粒的诱导表达与鉴定
• 2.7 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的预测
• 3 结果和分析
• 3.1 RT-PCR 产物的鉴定
• 3.2 重组克隆质粒的酶切鉴定
• 3.3 重组原核表达质粒的酶切鉴定与测序
• 3.4 表达产物SDS-PAGE 电泳
• 3.5 表达产物的Western-bloting 鉴定
• 3.6 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的分析
• 4 讨论
• 第二章 鸡 IL-2 cDNA 及其去信号肽cDNA 酵母表达
• 1 材料
• 1.1 菌株和载体
• 1.2 工具酶和主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 酵母重组表达质粒的构建
• 2.2 酵母重组表达质粒提取与鉴定
• 2.3 毕赤酵母菌的转化
• 2.4 重组菌株的筛选与鉴定
• 2.5 重组酵母菌的诱导表达与鉴定
• 2.6 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的预测
• 3 结果和分析
• 3.1 重组表达质粒的鉴定
• 3.2 重组表达质粒线性化
• 3.3 高抗性重组酵母菌株的筛选
• 3.4 重组酵母菌株基因组的PCR 鉴定
• 3.5 重组酵母菌株的诱导表达
• 3.6 Western-blotting 鉴别表达产物
• 3.7 预测ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩写词英汉对照表
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介