论文摘要
急性肾损伤（AKI）是危重症病人常见并发症和重要死亡原因。在AKI中以缺血性急性肾损伤最常见。缺血性急性肾损伤多为可逆性,及时发现和治疗可防止其发展成肾实质性肾衰竭。由于其早期临床症状不明显,致使部分病人因肾脏低灌注不能及时纠正,组织长时间缺血缺氧最终发生肾实质性肾衰竭。目前临床上缺乏早期诊断缺血性AKI和判断疗效的指标。血清肌酐可反映肾功能,但在AKI时血清肌酐的升高出现较晚,缺乏敏感性和特异性;反映肾损伤的一些尿蛋白指标也无法被早期检测。因此,尽可能的早期诊断AKI是一项非常迫切的任务。近年来研究发现,动物模型中肾脏缺血后Cyr61蛋白可迅速升高,在肾缺血3至6小时即可在尿中检测到Cyr61,其出现不仅早于血肌酐、尿蛋白,而且也较肾脏损伤分子-1早。但现有的检测需要肝素亲和纯化过程,方法繁琐;又不能定量,限制了其临床应用。因此建立Cyr61蛋白简便、快速、准确的检测方法具有重要的现实意义。本研究由三部分组成:一、Cyr61在缺血性急性肾损伤肾组织及体液中的表达研究Cyr61广泛存在于心、肺、脑、胰腺、胎盘、胎肾,在成人肾组织极低表达。在本实验中,我们建立了缺血性急性肾损伤大鼠模型,利用抗大鼠Cyr61多克隆抗体和自行设计的Cyr61荧光定量PCR探针,采用高敏感性和特异性的免疫组化和荧光定量PCR方法研究Cyr61在缺血性急性肾损伤大鼠肾组织中的表达和分布;利用Western Blotting分析Cyr61蛋白在缺血性急性肾损伤大鼠肾组织中表达的改变,并观察其释放至体液中的含量。结果发现,Cyr61在缺血性急性肾损伤肾组织的肾小管上皮细胞表达上调,正常肾组织近端小管、远端小管和集合管细胞内未见阳性结果。荧光定量PCR显示:急性肾缺血1h后,肾组织中Cyr61 mRNA表达明显增高,4h达高峰。伪手术组肾组织中Cyr61 mRNA表达在手术2～8h轻度增高,但与正常组无显著性差异。缺血性急性肾损伤组尿液中Cyr61在缺血2h后开始显著增高,4～8h达高峰,12h开始减退。此外,缺血性急性肾损伤组血清中Cyr61在1～4h显著增高。正常组和伪处理组血清中均可检测出少量Cyr61。二、缺血性急性肾损伤患者体液Cyr61定量检测提取乳腺癌组织总RNA,根据已知的Cyr61 mRNA序列（GenBank Z98053）,采用RT-PCR扩增Cyr61基因399～1329bp片断,其表达产物为Cyr61蛋白肽片断（133-433AA）,并将其克隆到融合蛋白表达载体pQE80L中,构建的表达载体pQE80L+Cyr61经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒后,将其转染入感受态大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达氨基端有6个连续组氨酸的融合蛋白,用Ni-NTA Agarose行亲和层析纯化融合蛋白。纯化产物经聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）显示出相对分子量为32kD的融合蛋白,经Western blot鉴定为Cyr61肽片断的融合蛋白。我们利用针对Cyr61中段和羧基端不同位点的多克隆抗体,建立抗体夹心ELISA方法,定量检测心脏手术后患者不同时段体液中的Cyr61蛋白。结果发现体外循环后急性肾损伤组血清中Cyr61在4～8h与同时间段无肾损伤组相比显著增高,肾损伤及无肾损伤组血清中Cyr61在2～12h与0h相比显著增高（P值均＜0.05）;急性肾损伤组尿液中Cyr61在术后2h开始增高,6～8h达高峰,12h开始减退,持续至60h（P值均＜0.01）。分别用血肌酐、尿肌酐标化蛋白定量检测结果,标化后各组间统计学意义与标化前无差别。三、丝裂原活化蛋白激酶对缺氧时人肾小管上皮细胞Cyr61转录活性的调控低氧培养人肾小管上皮细胞（HKC）,Northern blot检测Cyr61mRNA表达,Western blot检测Cyr61、p38、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、c-Jun-N末端蛋白激酶（JNK）以及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达;构建含有人Cyr61基因启动子的报告基因Cyr61-luc质粒,将其单独或者分别与表达活性丝裂原活化蛋白酶激酶的质粒Ca-MEK1和Ca-MKK6共同瞬时转染HKC细胞,通过荧光素酶活性检测观察缺氧、MAPK抑制剂和MAPK活性酶对Cyr61基因转录活性的调控。结果显示:低氧时HKC细胞表达Cyr61、HIF-1α增高,ERK1/2、JNK、p38总量不变,而其各自的磷酸化形式均明显增加。HKC细胞转染Cyr-luc后,p38通路抑制剂SB203580和ERK通路抑制剂PD98059显著抑制低氧时Cyr61的转录活性,两者协同作用时的抑制作用显著增强;Ca-MEK1与Cyr-luc共转染HKC细胞后,Cyr61的转录活性无改变,而Ca-MKK6与Cyr-luc共转染后,Cyr61的转录活性显著增高。对缺氧培养的HKC细胞,PD98059处理使HIF-1α和Cyr61蛋白的表达显著降低,SB203580处理可显著降低Cyr61蛋白的表达,但对HIF-1α无影响。PD98059和SB203580联合处理对Cyr61的抑制显著强于各自单独处理。以上研究表明,Cyr61在缺血性急性肾损伤大鼠模型肾组织的肾小管上皮细胞表达增加,同时其尿液中Cyr61在缺血2h后开始显著增高,6～8h达高峰;体外循环后急性肾损伤患者血清中Cyr61在4～8h显著强于无肾损伤组,肾损伤及无肾损伤组血清中Cyr61在2～12h较手术前显著增高。同时急性肾损伤组尿液中Cyr61在术后2h开始增高,6～8h达高峰,12h开始减退,持续至60h;在HKC中,缺氧可通过p38通路直接上调Cyr61基因启动子活性,也可通过ERK1/2途径促进HIF-1α表达,间接调节Cyr61基因启动子活性。
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标签：急性肾损伤论文; 缺血论文; 富含半胱氨酸蛋白论文; 定量检测论文; 低氧丝裂原活化蛋白激酶论文; 基因表达调控论文;