大菱鲆免疫相关基因cystatin B的克隆表达和功能分析

论文摘要

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)是一类广泛分布的半胱氨酸蛋白酶抑制因子,在哺乳动物的正常生理状态和病理过程中发挥着重要作用。但在鱼类中对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究却很少。本研究发现并鉴定分析了大菱鲆(Scophthalmus maximus)半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(SmCytB)。SmCytB的开放阅读框长度为300bp,编码99个氨基酸残基,与多种鱼类Cystatins B的序列具有较高的同源性,并具有Cystatins B的保守性功能活性位点。正常生理条件下,SmCytB在肌肉、脑、心脏,肝脏的表达量较高,而在脾脏、血液、腮、肾中表达量相对较低;细菌侵染时,肾、脾、肝、脑中SmCytB表达量显著上升,而在肌肉、心脏中表达量水平变化不大。体外原核表达重组的SmCytB具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。SmCytB在大菱鲆头肾巨噬细胞过量表达能显著增强巨噬细胞杀菌能力,且这种增强机制不依赖于一氧化氮途径。综上所述,SmCytB与大菱鲆的抵抗细菌感染的免疫防御密切相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 大菱鲆简介
• 1.2 鱼类免疫系统
• 1.3 半胱氨酸蛋白酶
• 1.4 半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 分类
• 1.4.3 Cystatin 结构域
• 1.4.4 Cystatin 的功能
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 Cystatin B全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 cDNA文库构建前实验动物的处理
• 2.1.3 大菱鲆cDNA文库的构建
• 2.1.4 大菱鲆cDNA文库的筛选与Cystatin B基因部分序列的获得
• 2.1.5 大菱鲆 Cystatin B 全长 cDNA 的获得
• 2.1.6 Cystatin B序列的生物信息学分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 Cystatin B 全长 cDNA 的获得
• 2.2.2 SmCytB的序列分析
• 2.2.3 SmCytB的同源性对比和活性位点分析
• 2.2.4 SmCytB蛋白同源物的进化树分析
• 第三章 rSmCytB 的克隆、表达纯化和功能分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 SmCytB 基因的克隆
• 3.1.3 SmCytB基因的序列鉴定
• 3.1.4 重组蛋白 rSmCytB 的表达
• 3.1.5 rSmCytB蛋白的纯化
• 3.1.6 rSmCytB蛋白的抑制活性检测
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 SmCytB的克隆
• 3.2.2 rSmCytB表达和纯化
• 3.2.3 rSmCytB的活性测定
• 第四章 大菱鲆半胱氨酸蛋白酶抑制剂SmCytB的功能研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 荧光定量实时PCR分析SmCytB在大菱鲆组织中的表达情况
• 4.1.3 细菌刺激后SmCytB 在鱼体组织内表达量变化的分析研究
• 4.1.4 大菱鲆巨噬细胞SmCytB过量表达
• 4.1.5 SmCytB过量表达鉴定
• 4.1.6 SmCytB过量表达对头肾巨噬细胞杀菌活性的影响
• 4.1.7 SmCytB过量表达对头肾巨噬细胞NO产生的影响
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 SmCytB在大菱鲆中的组织特异性分析
• 4.2.2 细菌刺激后SmCytB在鱼体组织内表达量变化情况
• 4.2.3 对转染子进行实时荧光定量PCR测定SmCytB的转录水平
• 4.2.4 免疫印记法（western blot）测定SmCytB蛋白表达
• 4.2.5 SmCytB 过量表达对头肾巨噬细胞杀菌活性的影
• 4.2.6 SmCytB过量表达对大菱鲆头肾巨噬细胞NO产生的影响
• 结论
• 参考文献
• 附录— 培养基与溶液的配置
• 硕士期间发表的文章
• 致谢